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①臨床標(biāo)本中存在的大量待測(cè)微生物或待測(cè)靶核酸

②科研中得到的質(zhì)粒克隆

③以前分析研究的特定微生物或靶核酸

④大量存在于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中的特定微生物或靶核酸

⑤以前擴(kuò)增產(chǎn)物的殘留污染,這也是 PCR 實(shí)驗(yàn)室最容易產(chǎn)生的將造成假陽(yáng)性的“污染”。 

PCR擴(kuò)增可以引起實(shí)驗(yàn)室中擴(kuò)增產(chǎn)物的累積,通常一次典型的PCR 擴(kuò)增可以產(chǎn)生109拷貝的靶序列,如果氣溶膠化,甚至最小的氣溶膠都會(huì)含有106拷貝的擴(kuò)增產(chǎn)物。如果不加以控制,在短期內(nèi)累積的氣溶膠化的擴(kuò)增產(chǎn)物即會(huì)污染實(shí)驗(yàn)室中的試劑、儀器設(shè)備和通風(fēng)系統(tǒng),從而造成嚴(yán)重的實(shí)驗(yàn)室“污染”,出現(xiàn)大量的假陽(yáng)性結(jié)果。

進(jìn)行PCR操作時(shí)，操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)。

(一) 劃分操作區(qū)

目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實(shí)現(xiàn)完全閉管操作，但無(wú)論是否能夠達(dá)到單人單管，均要求實(shí)驗(yàn)操作在三個(gè)不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行：

1.  試劑準(zhǔn)備區(qū)。

2．標(biāo)本制備區(qū)。

3.  PCR擴(kuò)增區(qū)及分析區(qū)。

各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專(zhuān)用，要有一定的方向性。如：試劑準(zhǔn)備→標(biāo)準(zhǔn)制備→PCR擴(kuò)增區(qū)及分析區(qū)。

切記：任何一間的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個(gè)工作區(qū)。

(二) 分裝試劑

PCR擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在生物安全柜、裝有紫外燈的超凈工作臺(tái)或負(fù)壓工作臺(tái)配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來(lái)吸取擴(kuò)增后的DNA和其他來(lái)源的DNA：

1．PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水；

2．引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無(wú)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)配制；

3．引物和dNTP應(yīng)分裝儲(chǔ)存，分裝時(shí)應(yīng)標(biāo)明時(shí)間，以備發(fā)生污染時(shí)查找原因。

(三) 實(shí)驗(yàn)室的嚴(yán)格分區(qū)及工作程序的嚴(yán)格遵守

試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本準(zhǔn)備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、檢測(cè)區(qū)等必須備有其各自必需的儀器設(shè)備、工作服、手套、加樣器和通風(fēng)系統(tǒng)。在每個(gè)區(qū)使用的試劑和廢物,必須直接在其各自的區(qū)域內(nèi)分裝或包裝。操作人員必須注意防止通過(guò)他們的頭發(fā)、眼鏡、首飾和衣服將擴(kuò)增產(chǎn)物從污染區(qū)攜帶至清潔區(qū)的可能性。

(四)化學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)臺(tái)面可使用10%的次氯酸鈉(漂白劑)清洗,然后再用70%乙醇或清水洗去次氯酸鈉。次氯酸鈉具有氧化損傷核酸的作用,從而使可能的留在實(shí)驗(yàn)臺(tái)面的擴(kuò)增產(chǎn)物被破壞掉。要注意的是,次氯酸鈉不能區(qū)分提取的目的 DNA 和 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物,用次氯酸鈉處理的樣本不能用于核酸擴(kuò)增檢測(cè)。在實(shí)際工作中,有些物品比如放置擴(kuò)增反應(yīng)管的盤(pán)必須從污染區(qū)轉(zhuǎn)回到清潔區(qū)時(shí),在轉(zhuǎn)回之前,應(yīng)將其置于2%~10%的次氯酸鈉溶液中過(guò)夜,并充分沖洗。

(五)擴(kuò)增產(chǎn)物的修飾

如對(duì)以前擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行適當(dāng)修飾,應(yīng)可以消除其污染后面新的擴(kuò)增檢測(cè),但為保證不影響靶核酸的擴(kuò)增檢測(cè),擴(kuò)增產(chǎn)物修飾方法必須遵循兩個(gè)基本原則:

一是擴(kuò)增產(chǎn)物被修飾后,應(yīng)可以與隨后打增的靶序列區(qū)分

二是修飾不能干擾正常的擴(kuò)增檢測(cè)。

不同消除擴(kuò)增產(chǎn)物污染的方法優(yōu)缺點(diǎn)比較

圖片來(lái)自《實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)》

(六) 實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)

盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽(yáng)性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：

1.  戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套；

2.  使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；

3.  避免反應(yīng)液飛濺，打開(kāi)反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況，開(kāi)蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；

4.  操作多份樣品時(shí)，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度；

5.  最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管；

6.  操作時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照，即可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性；

7.  盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒(méi)有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過(guò)程中加樣器應(yīng)該專(zhuān)用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區(qū)；

8.  重復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果，慎下結(jié)論。

一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室，要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測(cè)，考慮有無(wú)污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。

對(duì)照試驗(yàn)

1、陽(yáng)性對(duì)照：在建立PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽(yáng)性對(duì)照，它是PCR 反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。陽(yáng)性  對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本，如以重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，其含量宜低不宜高(100個(gè)拷貝以下)。但陽(yáng)性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽(yáng)性標(biāo)本，其對(duì)檢測(cè)或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大.因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)  定，檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí)，在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽(yáng)性對(duì)照。

2、陰性對(duì)照：每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對(duì)照。它包括①標(biāo)本對(duì)照：被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對(duì)照；被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對(duì)照。②試劑對(duì)照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測(cè)試劑是否污染。

3、重復(fù)性試驗(yàn)

4、選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增

實(shí)驗(yàn)室一旦發(fā)生污染，檢測(cè)工作應(yīng)立即停止，直到確認(rèn)消除污染后才能重新開(kāi)始檢測(cè)。首先，要查找污染源和明確污染范圍。然后，根據(jù)污染源和污染范圍采取有效的去污染措施，結(jié)合各種不同方法以達(dá)到最佳效果。

1.標(biāo)本污染生物安全柜的操作臺(tái)造成局限污染時(shí)：

立即用吸水紙覆蓋，并使用0.55%含氯消毒劑進(jìn)行噴灑消毒。消毒液需要現(xiàn)用現(xiàn)配，24小時(shí)內(nèi)使用。

2.標(biāo)本傾覆造成實(shí)驗(yàn)室污染時(shí)：

保持實(shí)驗(yàn)室空間密閉，避免污染物擴(kuò)散。立即使用潤(rùn)濕有0.55%含氯消毒劑的毛巾覆蓋污染區(qū)。必要時(shí)（如大量溢撒時(shí)）可用過(guò)氧乙酸加熱熏蒸實(shí)驗(yàn)室，劑量為2g/m3，熏蒸過(guò)夜；或20g/L過(guò)氧乙酸消毒液用氣溶膠噴霧器噴霧，用量8ml/m3，作用1-2小時(shí)；必要時(shí)或用高錳酸鉀-甲醛熏蒸：高錳酸鉀8g/m3，放入耐熱耐腐蝕容器（陶罐或玻璃容器），后加入甲醛（40%）10ml/m3，熏蒸4小時(shí)以上。熏蒸時(shí)室內(nèi)濕度60%-80%。

3.清理污染物時(shí)：

嚴(yán)格遵循活病毒生物安全操作要求，采用壓力蒸汽滅菌處理，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室換氣等，防止次生危害。

答：如果是個(gè)別單一通道翹尾，不管是FAM還是VIC通道，首先按照要求復(fù)查，復(fù)查建議重新采樣，如果不方便重新采樣建議對(duì)原有樣本進(jìn)行重新提取核酸驗(yàn)證，如果復(fù)查陰性判讀陰性，如果復(fù)查還是同一通道翹尾，就要對(duì)結(jié)果仔細(xì)審核，一是要排除實(shí)驗(yàn)室污染，二是要對(duì)病人信息了解清楚，從臨床癥狀及接觸史排查，如果沒(méi)法確認(rèn)，建議必須重新采樣復(fù)查，如有必要可以采用另一家試劑來(lái)驗(yàn)證。如果出現(xiàn)大量的弱陽(yáng)性擴(kuò)增翹尾，首要原因是考慮實(shí)驗(yàn)室污染，可以通過(guò)做環(huán)境樣本和陰性對(duì)照做驗(yàn)證排除。

2、N基因和1ab基因是新冠病毒的特有基因嗎，靈敏度哪個(gè)更高？是否會(huì)和其他冠狀病毒片段重疊？

答：N基因跟1ab都是特異的，不會(huì)跟其他呼吸道病原體交叉反應(yīng)。設(shè)計(jì)時(shí)候，兩個(gè)基因的序列不一樣，導(dǎo)致靈敏度不一樣，N基因的靈敏度比1ab靈敏度高。

3、新冠檢測(cè)結(jié)果和臨床診斷不符合，怎么解讀？

答：新冠病毒由于是RNA病毒，容易降解，另外檢測(cè)結(jié)果也和取樣，核酸提取以及樣本本身的核酸濃度有關(guān)，需要逐一分析，同時(shí)可以結(jié)合臨床癥狀判讀。

4、采用生理鹽水做陰性對(duì)照，內(nèi)標(biāo)也會(huì)增長(zhǎng)，怎么解釋?zhuān)?/span>

答：因?yàn)樵噭┎捎玫氖莾?nèi)源性?xún)?nèi)標(biāo)，內(nèi)源性?xún)?nèi)標(biāo)是用人源基因標(biāo)記，此基因存在于人的表皮細(xì)胞內(nèi)，操作過(guò)程中就可能會(huì)出現(xiàn)人源性的污染，另外環(huán)境污染也有可能導(dǎo)致內(nèi)標(biāo)增長(zhǎng)，這也是前面提到的建議做環(huán)境樣本質(zhì)控。

5、新冠樣本內(nèi)標(biāo)不出如何處理？

答：如果新冠樣本內(nèi)標(biāo)不出，該樣本必須復(fù)查，可重新混勻該樣本提取核酸，如果重新提取該樣本內(nèi)標(biāo)還是不出，在排除提取問(wèn)題的情況下，說(shuō)明采樣不合格，要通知臨床重新采樣復(fù)查。

6、采集環(huán)境樣本檢測(cè)新冠狀病毒，為啥大部分樣本內(nèi)標(biāo)不出，偶爾個(gè)別樣本檢測(cè)出內(nèi)標(biāo)？

答：因?yàn)樾鹿谠噭z測(cè)的是人內(nèi)源性?xún)?nèi)標(biāo)，環(huán)境樣本一般不含有人源細(xì)胞，所以檢測(cè)不出內(nèi)標(biāo)；偶爾檢出內(nèi)標(biāo)，可能該環(huán)境樣本上有人源性細(xì)胞粘附，故而檢出內(nèi)標(biāo)。

最后是兩條有用的小訣竅：

● 面對(duì)多份樣品，制備反應(yīng)混合液時(shí)，先將 dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后用分液功能進(jìn)行分裝。

● 在加入模板時(shí)，按照“陰性對(duì)照-待測(cè)樣品-陽(yáng)性對(duì)照”的加樣順序，操作上應(yīng)遵循“開(kāi)管蓋-加模板-蓋管蓋”的原則。

本文由檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)整理自：

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所

《醫(yī)療機(jī)構(gòu)新冠病毒核酸檢測(cè)工作手冊(cè)》（試行第二版）

《實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)》（第二版）