【Nature Communications】血管緊張素轉換酶抑制劑通過Sp1/Sp3介導抑制notch信號促進雄性小鼠血管生成
缺血性心血管疾病，以中風、CLI和MI為代表，已成為全球發病率和死亡率的主要原因，在生理和病理條件下，包括發育、傷口愈合、缺氧和缺血等，血管新生對維持血管穩態至關重要，對宿主修復和治療干預都具有決定性作用。血管新生包括血管血皮細胞（ECs）的激活、增殖、遷移、分化、分支、吻合、管腔形成以及從原有的血管重塑成動脈和靜脈。血管新生是器官生長和各種疾病的重要病理生理過程，高效的血管生成有助于缺血性疾病，如缺血性心臟病或嚴重肢體缺血，然而，過度和不平衡的血管生成導致惡性、炎癥和視網膜疾病。轉錄因子Sp1/Sp3是胎兒發育和腫瘤生長所必需的。最近研究發現sp1和Sp3似乎與血管生成密切相關，尤其是血管內皮生長因子。然而，內皮Sp1/Sp3在體內血管生成中的作用尚未得到很好的研究。近期，來自山東大學張文程教授團隊在《Nature Communications》上發表了Angiotensin-converting enzyme inhibitor promotes angiogenesis through Sp1/Sp3-mediated inhibition of notch signaling in male mice一文， 揭示了內皮細胞USP7-Sp1/Sp3Notch1信號在ACEI治療反應的病理生理性血管生成中起著核心作用。圖1: 敲除ECs中的Sp1/Sp3可減少體內血管生成作者首先使用免疫熒光染色評估了Sp1/Sp3在人類樣本中的表達，發現與健康對照組相比，CLI患者腓腸肌樣本中與核(DAPI)和cd31標記的血管內皮共定位的Sp1/Sp3在肌纖維周圍和血管周圍顯著減少。接著作者構建了VE-CAD-CreERT2+/Sp1fl/fl/Sp3fl/fl (dKO)小鼠， 使用視網膜血管生成模型來檢測P5幼崽小鼠視網膜中的血管生成萌芽，小鼠后肢缺血(HLI)模型檢測修復性血管生成反應，皮膚傷口愈合模型被用來估計宿主對損傷的防御反應，以及腫瘤模型中觀察血管新生，揭示了人類和嚙齒動物Sp1/Sp3下調導致血管生成條件減弱，減少體內血管生成。已有的文章證明，ACEI促進體內血管生成，接著，作者研究了Sp1/Sp3上調是否有助于ACEI誘導的出生后血管生成的原血管生成表型，發現ACEI治療無法增加dKO小鼠的視網膜血管面積、血管長度、分支點、尖端細胞和尖端芽的數量。通過體外主動脈環發芽模型驗證Sp1/Sp3在acei介導的促血管生成作用中的作用。與體內試驗相對應，來自dKO小鼠的主動脈環對ACEI無反應。體外實驗中作者從CTR和dKO小鼠中分離出小鼠肺內皮細胞(MLECs)，證明ECs中的Sp1和Sp3在ACEI的促血管生成作用中起著重要作用。圖3：ACEI通過Sp1/Sp3促進病理性血管生成為了研究內皮Sp1/Sp3在ACEI存在的成人病理性血管生成中的作用，作者使用了HLI小鼠模型，顯示ACEI無法增加dKO小鼠腓腸肌內血流恢復和CD31+毛細血管密度。作者進一步采用了皮下Matrigel堵塞血管生成實驗和腫瘤血管生成實驗證明，內皮Sp1和Sp3在ACEI介導的生理性和病理性血管生成中起關鍵作用。為了探究Sp1/Sp3缺失如何消除ACEI在血管生成中的作用，以及ACEI是否直接調節內皮細胞的Sp1/Sp3，作者使用siRNA來研究關鍵的去泛素酶，在用ACEI預處理過的人臍血管內皮細胞(HUVECs)中，只有usp7缺陷的siRNA降低了Sp1和Sp3蛋白水平，USP7屬于最大的泛素特異性蛋白酶(USP)家族。使用泛素-蛋白酶體抑制劑MG132減弱USP7 siRNA誘導的HUVECs Sp1/Sp3降低，環已酰亞胺處理后USP7的下調顯著損害了Sp1/Sp3的穩定性。為了確定USP7對ACEI治療小鼠視網膜萌芽血管生成增強的貢獻，作者測試了兩種選擇性USP7抑制劑P22077和P5091在視網膜血管生成中的作用，P5時視網膜血管發育分析顯示，選擇性USP7抑制劑P22077-或p5091 -處理的小鼠表現出延遲性血管叢擴張，在發育中的脈管系統，葉尖細胞、葉尖芽和絲狀足的數量減少，體外實驗HUVECs的結數和相對管長減少，都證明了抑制USP7對于血管生成的抑制作用。在HLI條件下，小鼠的USP7抑制也表現出有害的表型。證明內皮細胞中USP7保護的Sp1/Sp3有助于ACEI的促血管生成作用。 圖5：ACEI通過USP7介導的去泛素化穩定Sp1/Sp3蛋白USP7是一種去泛素化酶，通過直接去泛素化來控制蛋白水平，因此作者提出假設：USP7通過與Sp1和Sp3相互作用導致其去泛素化來調節Sp1和Sp3的穩定性，為了驗證這一假設，作者進一步研究了USP7對Sp1和Sp3多泛素化的影響。在HEK293T細胞中，異位表達USP7-WT，在共免疫沉淀(Co-IP)實驗中降低了Sp1和Sp3的泛素化水平，在USP7抑制劑P22077和P5091處理的HEK293T細胞中也觀察到類似的現象。接著，通過在HUVECs中過表達USP7- wt或USP7- cs（催化失活突變體USP7-CS），發現USP7- cs完全抑制了ACEI誘導的血管生成。為了進一步驗證Sp1/Sp3上的多泛素鏈被USP7去除，作者將突變體轉染HEK293T細胞，結果顯示，K48的突變明顯破壞了USP7介導的Sp1/Sp3去泛素化，USP7和Sp1/ Sp3之間依賴于USP7的n端trf樣結構域(1-208 aas)的相互作用。定量ChIP實驗中，ACEI處理增強了NOTCH1啟動子上Sp1或Sp3的富集。相比之下，P22077或P5091處理顯著削弱了觀察到的ACEI誘導富集的增加。上述實驗證明，USP7通過增加Sp1/Sp3的積累，在ACEI介導的Sp1/Sp3轉錄功能上調中發揮關鍵作用。乙酰化被認為是蛋白質中的一種進化保守修飾，在蛋白質穩定性中發揮重要作用，為了闡明乙酰化在Sp1/ Sp3穩定性調控中的機制，用阻斷HDAC1的抑制劑TSA或SAHA處理HUVECs，以及HDAC1 siRNA轉染到HUVECs，這些處理都能消除ACEI引起的USP7和Sp1/Sp3相互作用的增加。考慮到HDAC1抑制對Sp1/ Sp3泛素化的促進作用，我們生成了Sp1和Sp3突變體，Co-IP實驗顯示，與野生型Sp1或Sp3相比，Flag-Sp1-K703A或Flag-Sp3-K551R與USP7的相互作用更強。結果表命在ACEI存在的情況下，HDAC1介導的Sp1/Sp3去乙酰化導致它們與USP7的相關性增加。為了探究ACEI處理的內皮細胞中Sp1/Sp3去泛素化的增加是否與USP7核定位相關，作者在核亞細胞部分分別使用Sp1或Sp3抗體進行免疫共沉淀試驗，發現USP7與Sp1/Sp3結合的時間延長，ACEI處理后Sp1/Sp3的泛素化水平降低，USP7轉位進入細胞核，免疫熒光染色證實了USP7的亞細胞分布。接著作者發現lys703位點Sp1乙酰化和Lys551位點Sp3乙酰化在ECs內ACEI誘導的血管生成反應中抑制HDAC1 siRNA修飾HUVECs管的形成。上述數據表明，在ECs中ACEI的促血管生成功能期間，USP7在細胞核中積累，它與Sp1/Sp3結合，保護Sp1/Sp3免受蛋白酶體降解。圖7：內皮Sp1/Sp3負向調控Notch信號以調控血管生成為了研究ECs中Sp1/Sp3和Notch信號通路之間的潛在聯系，作者從dKO小鼠的視網膜ECs中提取蛋白和mRNA，發現ECs中Sp1/Sp3缺失導致Notch1、NICD及其靶基因DLL4蛋白水平顯著升高，NOTCH1及其主要下游靶效應物HES1、HEY1和DLL4 mRNA表達水平顯著上調，免疫熒光染色證實Sp1/Sp3缺陷誘導的Notch1上調。作者進一步使用γ-分泌酶抑制劑DAPT (N- [N-(3,5 -二氟苯乙酰基)-l-丙酰]-s-苯甘氨酸-丁基酯)處理，DAPT處理在視網膜血管面積、血管長度、分支點以及尖端細胞、尖端芽和絹足的數量方面均顯著增加了血管密度和血管叢的擴張。后肢缺血模型證實，DAPT可改善缺血引起的病理性血管生成過程中內皮細胞Sp1/Sp3缺失的損害。Notch1介導的VEGF信號通路是EC遷移、增殖和毛細管形成的關鍵驅動因素。在LLC異種移植的dKO小鼠腫瘤中，CD31標記的血管中VEGFR2表達下調，Notch1表達上調。作者進一步通過用mithramycin (Sp1和Sp3抑制劑)治療HUVECs來檢測Sp1/Sp3在VEGF信號通路中的作用，發現用mithramycin或Ad-NICD過表達NICD處理導致VEGF誘導的VEGFR2磷酸化及其下游信號p-PLCγ (Y783)和p-ERK1/2 (T202/Y204)顯著降低。體外毛細血管形成實驗和dKO小鼠的主動脈環實驗表明，VEGF和Ang1共同作用促進dKO MLECs的血管生成，提示Sp1/Sp3缺失只是阻斷了VEGF信號，在用ACEI預處理的HUVECs中，P22077和P5091顯著抑制vegf誘導的VEGFR2、PLCγ和ERK1/2磷酸化，證明了Notch1-VEGFR2信號通路參與ACEI-Sp1/Sp3調控血管生成的機制。圖8：Sp3增強了Sp1介導的Notch1在ECs中的轉錄抑制活性為了進一步探索Sp1和Sp3的不同作用，用Sp1或Sp3 siRNA處理HUVECs。敲除導致Notch1、NICD和DLL4蛋白水平上調，Notch1、HES1、HEY1和DLL4 mRNA水平上調。接著過表達(OE) ECs中進行siRNA介導的Sp1敲除或在Sp1 OE ECs中進行Sp3敲除。Sp3 OE ECs中的Sp1下調導致Notch1信號強烈激活，Sp3 siRNA處理的Sp1 OE ECs不激活Notch1信號，表明sp3介導的Notch1信號的失活依賴于Sp1的存在，同時使用Sp1和Sp3 siRNA下調表達誘導Notch1信號進一步上調，表明Sp1和Sp3之間存在合作關系。Sp1/Sp3通過與靶基因調控區域的GC-box序列結合來調節轉錄。一些GC-box基序靠近NOTCH1轉錄起始位點(TSS)。利用染色質免疫沉淀(ChIP)驗證了Sp1和Sp3與NOTCH1啟動子相互作用。為了進一步了解Sp1和Sp3對NOTCH1的轉錄調控，作者克隆了NOTCH1熒光素酶報告基因上游不同的截斷啟動子，在-68到-35段觀察到NOTCH1啟動子活性，這表明這種最小的Ad-Sp1和Ad-Sp3響應元件在調節NOTCH1轉錄中起作用。進一步驗證NOTCH1啟動子中Sp1和Sp3的假定轉錄因子結合位點，作者準備了單個位點的替代突變，與野生型啟動子相比，這導致轉錄抑制活性顯著降低。此外，siRNA敲除HEY1/HES1減弱了adnicd誘導的VEGFR2啟動子抑制，這些結果表明Sp1/Sp3結合NOTCH1啟動子并抑制其轉錄。為了確定內皮Sp1和Sp3在促進血管生成中的獨立作用，研究發現Sp1ECKO小鼠和Sp3ECKO小鼠的視網膜在血管發育表型上表現出輕微的延遲。此外，來自Sp1ECKO小鼠的視網膜比Sp3ECKO小鼠表現出更嚴重的血管生成受損，這表明Sp1在ECs血管生成中的作用優于Sp3。綜上所述，這些發現表明Sp3可以增強sp1介導的NOTCH1在ECs中的轉錄抑制活性。本文研究結果表明，內皮Sp1/Sp3通過抑制NOTCH1轉錄在血管生成中發揮重要作用，并為內皮Sp1/Sp3作為各種血管生成相關疾病(包括視網膜疾病)治療的潛在靶點提供了見解，CLI，甚至腫瘤。此外，通過HDAC1介導的去乙酰化和USP7介導的Sp1/Sp3的去泛素化描述了ACEI的促血管生成作用與Notch/VEGFR2系統之間的聯系，這有助于研究ACEI的藥理作用。參考文獻：Lu H, Yuan P, Ma X, Jiang X, Liu S, Ma C, Philipsen S, Zhang Q, Yang J, Xu F, Zhang C, Zhang Y, Zhang W. Angiotensin-converting enzyme inhibitor promotes angiogenesis through Sp1/Sp3-mediated inhibition of notch signaling in male mice. Nat Commun. 2023 Feb 9;14(1):731. doi: 10.1038/s41467-023-36409-z. PMID: 36759621; PMCID: PMC9911748.
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