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線粒體作為細(xì)胞的"能量中心"在細(xì)胞生命活動(dòng)過(guò)程中扮演著重要角色，它還是細(xì)胞核外存儲(chǔ)遺傳信息的另一細(xì)胞器。據(jù)MITOMAP數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)，在已確認(rèn)的97種線粒體遺傳疾病中，93種由點(diǎn)突變引起，因此使用堿基編輯工具修正這些突變具有重要意義。然而線粒體中的電子傳遞將質(zhì)子從線粒體基質(zhì)排出，使得基質(zhì)帶有強(qiáng)負(fù)電荷，這阻礙了具有相同負(fù)電荷核酸（如CRISPR系統(tǒng)的sgRNA）的進(jìn)入。全蛋白基礎(chǔ)的基因編輯工具ZFN和TALEN可以在定位信號(hào)的引導(dǎo)下進(jìn)入線粒體，之前有研究報(bào)道在小鼠線粒體中可以據(jù)此靶向敲低突變的基因組。然而，敲低線粒體基因組不能治療純合的線粒體突變，也不能主動(dòng)改變線粒體基因組的堿基構(gòu)成。

基于CRISPR-Cas系統(tǒng)開發(fā)的單堿基編輯在治療基因組點(diǎn)突變引起的遺傳疾病方面顯示出巨大潛力。堿基編輯器中使用的脫氨酶都是單鏈DNA脫氨酶，在Cas9和sgRNA的作用下，目標(biāo)DNA雙鏈中的非靶向鏈暴露出來(lái)，為單鏈DNA脫氨酶實(shí)現(xiàn)有效堿基轉(zhuǎn)換提供了必要條件。與CRISPR-Cas系統(tǒng)相比，鋅指蛋白（ZF）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)子（TALE）只具有結(jié)合DNA雙鏈的活性，卻無(wú)法解開DNA雙鏈。因此，簡(jiǎn)單將單鏈DNA脫氨酶與ZF或TALE結(jié)合無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA的有效堿基編輯。

2020年，Joseph Mougous實(shí)驗(yàn)室和劉如謙實(shí)驗(yàn)室利用一種能夠作用于雙鏈DNA的脫氨酶DddA開發(fā)出了線粒體單堿基編輯器，首次實(shí)現(xiàn)了線粒體基因C to T的堿基編輯。2022年Jin-Soo Kim實(shí)驗(yàn)室使用DddA和TadA8e組合，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了線粒體基因組A to G的堿基編輯。然而，左二偉實(shí)驗(yàn)室和伊成器實(shí)驗(yàn)室隨后發(fā)現(xiàn)DddA系統(tǒng)存在比較嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)，特別是DddA與CTCF存在相互作用，會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞核基因組的非特異性編輯。

2023年5月22日，北京大學(xué)魏文勝團(tuán)隊(duì)在 Nature Biotechnology 期刊發(fā)表了題為：Strand-selective base editing of human mitochondrial DNA using mitoBEs 的研究論文。

該研究開發(fā)了一種名為mitoBE的全新線粒體單堿基編輯工具，該工具不依賴于DddA系統(tǒng)。mitoBE不僅能夠高效地實(shí)現(xiàn)A to G或C to T的單堿基編輯，還具備選擇性地編輯特定鏈的能力，這是DddA系統(tǒng)所不具備的。此外，該工具未觀察到明顯的脫靶現(xiàn)象。

由于目前發(fā)現(xiàn)的除DddA之外的DNA脫氨酶，都只能作用于單鏈DNA，整個(gè)研究基于這樣的假設(shè)：在靶向位點(diǎn)產(chǎn)生瞬時(shí)的單鏈DNA，可以為所有“普通” 脫氨酶提供有效反應(yīng)底物。

在這項(xiàng)最新研究中，魏文勝實(shí)驗(yàn)室在TALE系統(tǒng)提供靶向的基礎(chǔ)上，整合了切口酶（nickase）和脫氨酶（deaminase），成功建立了高效的TALE版本的單堿基編輯器，實(shí)現(xiàn)了線粒體基因組的堿基編輯（mitochondrial DNA base editors，mitoBEs）。使用含有線粒體定位信號(hào)的TALE-MutH和TALE-TadA8e（V106W）靶向線粒體基因組，可以實(shí)現(xiàn)有效的A to G編輯（圖1）。對(duì)切口酶MutH的突變研究，可以大幅度突破其序列偏好，將可編輯范圍提高10倍以上。此外，無(wú)識(shí)別序列偏好的切口酶Nt.BspD6I（C）和FokI-FokI（D450A），也能夠有效應(yīng)用于mitoBEs系統(tǒng)（圖2）。

圖1：引入nickase來(lái)實(shí)現(xiàn)鏈選擇性DNA編輯及mitoBE工作模型

圖2：篩選可以用于mitoBE系統(tǒng)的無(wú)識(shí)別序列限制的nickase

除了A to G方向的編輯，TALE-MutH和TALE-rAPOBEC1-2×UGI的結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)C to T的高效堿基轉(zhuǎn)換。與DdCBE相比，mitoBEs具有鏈選擇性偏好。此外，通過(guò)全基因組測(cè)序，mitoBEs在線粒體和細(xì)胞核中都沒(méi)有檢測(cè)到嚴(yán)重的脫靶編輯，證明其具有高度特異性和安全性。

研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步嘗試這一新型編輯器在疾病治療中的應(yīng)用。Leber遺傳性視神經(jīng)病變（LHON）是一種由線粒體基因突變引起的急性眼部疾病，患者均為成年人。研究者利用環(huán)狀RNA編碼的mitoBEs實(shí)現(xiàn)了高效線粒體DNA鏈選擇性堿基編輯，成功建立了疾病模型。隨后，針對(duì)LHON患者來(lái)源的細(xì)胞，使用環(huán)狀RNA編碼的mitoBEs在目標(biāo)位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了約20%的編輯效率，修復(fù)后的細(xì)胞具有更高的ATP含量和氧化呼吸水平，表明mitoBEs對(duì)線粒體遺傳疾病具有治療潛力。這是首次通過(guò)堿基編輯方式修正了線粒體的致病突變（圖3）。由于理論上這一新技術(shù)能夠修正大多數(shù)線粒體疾病突變（圖3），這就為治療這些危害重大的疾病提供了有希望的治療方法。此外，該技術(shù)方案也適用于細(xì)胞核基因組的堿基編輯，對(duì)相關(guān)疾病治療提供了潛力巨大的新工具。

圖3：使用mitoBE糾正LHON病人來(lái)源細(xì)胞的線粒體基因突變

北京大學(xué)魏文勝課題組博士后伊宗裔、博士研究生張小雪為論文共同第一作者，魏文勝教授為論通訊作者，唐瑋、于瑩、魏曉旭和張雪對(duì)文章也作出了重要貢獻(xiàn)。該研究項(xiàng)目得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目、北京市科委生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新推進(jìn)項(xiàng)目、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、昌平實(shí)驗(yàn)室和中國(guó)博士后科學(xué)基金的支持。