北京大學生命科學學院李龍研究員課題組在Nature Structural & Molecular Biology雜志發表題為“Molecular pathway of mitochondrial preprotein import through the TOM-TIM23 supercomplex”的論文。該研究報道了線粒體中介導蛋白質轉運的TOM-TIM23超級復合體的結構和生化結果，揭示了蛋白質通過TOM復合物跨越線粒體外膜的新途徑，并重新定義了線粒體內膜TIM23轉運體復合物的核心組成。
線粒體作為真核細胞中最重要的細胞器之一，在能量供應、胞內代謝、體內平衡和細胞凋亡等過程中都扮演重要的角色。線粒體具有獨特的內外雙層脂膜結構，內部分布著超過1000種蛋白質。99%的線粒體蛋白質都是由細胞核基因編碼，在細胞質的核糖體中合成，并跨膜轉運至線粒體中發揮功能。因此，線粒體蛋白質的運輸對于維持和調控線粒體的活性至關重要，相關基因的突變與人類許多代謝疾病和癌癥的發生密切關聯。李龍課題組一直致力于探究線粒體蛋白質進入線粒體的分子機制，已經發表的工作包括解析線粒體膜蛋白通過TIM22轉運復合物進入內膜的途徑（Zhang Y. et al Cell Research 2021）。此次研究的TOM-TIM23超級復合物在線粒體蛋白轉運中的作用更為重要。這個超級復合物由數十種蛋白亞基組裝而成，跨越線粒體內外雙層膜，控制超過500種線粒體可溶蛋白和膜蛋白的運輸。在過去的40年里，研究人員對TOM和TIM23轉運復合物的各個亞基進行了廣泛而深入的研究。然而，由于該超級復合物的高度動態性，人們對于這些亞基如何組裝形成蛋白質轉運通路這一核心問題的了解仍然非常有限，尤其是內膜中的TIM23復合物，其核心轉運單元的組成一直很不明確。
在此項研究中，作者首先從組裝穩定的TOM-TIM23超級復合物入手，探索多種組裝方案，最終選擇將綠色熒光蛋白與線粒體蛋白質融合作為轉運底物，在酵母細胞內捕獲了TOM-TIM23超級復合物轉運蛋白質底物的中間狀態。經過體外提純，這種中間態仍然可以穩定存在，用于進一步的結構生物學和生物化學研究。通過冷凍電子顯微鏡單顆粒分析該中間態，作者發現位于外膜的TOM復合物和位于內膜的TIM23復合物存在直接相互作用，將線粒體內外膜連接起來，從而高效地將蛋白質底物從線粒體外膜向內膜傳遞（圖1a）。其中，TOM復合物的分辨率解析到了4.1?，該結構揭示了一條位于Tom40通道亞基內壁、在各個物種中都很保守的“極性氨基酸路徑”，該路徑介導蛋白質底物以非折疊的形式通過Tom40的中間孔道（圖1b）。這條路徑與之前基于生化實驗提出的Tom40中的兩條跨膜路徑均不相同，顯示出TOM復合物在高效識別和轉運各種線粒體蛋白質過程中的多能性。
圖1. TOM-TIM23超級復合物的結構。(a)TOM-TIM23超級復合物的組裝示意圖和冷凍電鏡結構。(b)包含蛋白質底物的TOM復合物的冷凍電鏡結構模型。(c) Tim17-Tim23-Mgr2異源三聚體的AlphaFold2結構模型
此外，作者在蛋白質底物的不同位點系統性地引入非天然氨基酸，利用光交聯技術探測了TOM-TIM23的轉運通路中蛋白質底物的周圍環境，從而鑒定出直接幫助底物跨越兩層脂膜的核心亞基。實驗結果顯示，蛋白質底物的C端片段可以與外膜的Tom40亞基交聯，這一結果與結構觀測相符。然而，令人意外的是，蛋白質底物的N端片段在內膜中與Tim17和Mgr2兩個亞基交聯，而不與普遍認定的構成內膜轉運通道的Tim23亞基交聯。這一結果表明，在過去的研究中，對TIM23復合物核心轉運通路的認知可能存在重大偏差。為了進一步確定TIM23中的核心轉運亞基及通路，作者綜合利用AlphaFold2建模、生化交聯、酵母遺傳學和線粒體蛋白質體外轉運等技術，發現TIM23復合物的核心成分是一個由Tim23、Tim17和Mgr2亞基組成的異源三聚體，其中Tim17和Mgr2面對面形成一個通道狀結構，而Tim23以背靠背的形式與Tim17結合，不參與通道的形成（圖1c）。在蛋白轉運的過程中，蛋白質底物穿過Tim17和Mgr2形成的通道狀結構，不直接與Tim23亞基接觸。突變實驗發現，在酵母中敲除Mgr2并不影響蛋白質轉運，說明在Tim17和Mgr2組成的通道狀結構中，只有Tim17是必需的。Tim17之所以可以幫助蛋白質穿過內膜是由于其獨特的表面氨基酸分布：一方面，Tim17在內膜入口處有一個高度保守的負電區域，可以破壞局部磷脂雙分子層結構，降低蛋白質穿過脂膜的能量勢壘；另一方面，在通路的中心，Tim17有一個保守的疏水區域，有助于線粒體內膜保持密閉狀態，維持線粒體各項生理活動所需的膜電勢。綜合各項結構和生化實驗結果，可以認定TIM23復合物以Tim17亞基為核心，采取混合模式幫助蛋白質轉運，即Tim17可以與其他亞基動態結合形成幫助蛋白質跨膜的通道，或者Tim17以插入酶的工作模式單獨完成蛋白質轉運，不需要通道的形成。這一結果更正了過去40年領域內認為Tim23亞基構成核心通道的錯誤認知。
綜上所述，這項研究開發了一套新穎的蛋白轉運研究策略，揭示了線粒體蛋白質通過TOM-TIM23超級復合物穿越雙層脂膜的關鍵路徑（圖2），顛覆了長期以來領域里對內膜TIM23轉運復合物的核心組分的認知，發現了全新的蛋白質轉運酶工作模式，為全面深入理解線粒體的生物合成奠定了堅實基礎。
圖2. 線粒體TOM-TIM23轉運通路
李龍為該論文通訊作者，北大-清華生命科學聯合中心2018級博士生周雪垠、生命科學學院2019級博士生楊玉琪、北京大學冷凍電鏡平臺王國鵬博士和生命科學學院2020級博士生王珊珊為共同第一作者。李龍實驗室前技術員孫東杰，生命科學學院2022級博士生歐曉敏、2021級博士生連宇珂為該研究工作作出重要貢獻。北京大學生命科學學院高寧教授和李寧寧副研究員、中國科學院生物物理研究所章新政研究員在冷凍電鏡數據計算方面提供了極大幫助，北京大學生命科學學院李晴教授和昌增益教授分別對酵母遺傳學和光交聯實驗提供了重要指導。該研究工作得到北京大學冷凍電鏡平臺、高性能計算中心、生命科學學院儀器中心以及國家鳳凰蛋白質平臺的大力支持，獲得膜生物學國家重點實驗室、北大-清華生命科學聯合中心和國家自然科學基金項目的資助。
