作者：第二軍醫大學附屬長海醫院關節骨病外科 鄒玉明
來源：中國矯形外科雜志
強直性脊柱炎(AS)是一種以骶髂關節和脊柱關節等中軸關節受累為主的慢性進行性炎癥性自身免疫性疾病，其具體病因和發病機制目前尚未完全闡釋清楚。在涉及關節的各類疾病中，AS僅次于類風濕性關節炎，發病率為第二位。典型的AS病理變化從最初的炎癥階段進展到骨化強直階段，最終發生關節融合。AS異位骨化涉及BMP、Wnt、Notch和Hedgehog等多條信號通路，各信號通路之間相互聯系、相互制約，形成一錯綜復雜的調節網絡。
目前對于AS炎癥與骨化的關系沒有統一的認識，主要有以下3種不同觀點:①炎癥引發新骨形成；②炎癥促進骨吸收從而抑制骨形成；③炎癥與骨化在一定程度上是兩個獨立的過程，沒有直接聯系。
炎癥引發新骨形成
眾多研究表明炎癥與新骨形成之間有一定關聯，炎癥能夠引發新骨形成，該過程中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)作為AS炎癥細胞網絡的關鍵因子，與Wnt/β-連環蛋白信號通路和BMP/Smad信號通路共同發揮重要作用，主要通過調節成骨細胞(OB)的骨形成作用，使之大于破骨細胞(OC)的骨吸收作用，從而導致新骨形成。骨形態發生蛋白(BMP)具有誘導軟骨內成骨的作用，共有20種亞型，除了BMP-1，其他亞型和轉化生長因子β(TGF-β)等細胞因子組成TGF-β超家族。
TGF-β與Smad(SmaAndMadHomo-logue)家族蛋白組成TGF-β/Smad信號通路，其中BMP/Smad通路有很強的成骨刺激作用。BMP信號與細胞表面受體I和II直接結合形成異聚體，使Smad1、Smad5、Smad8磷酸化，磷酸化的Smad在細胞核內與Smad4形成異二聚體復合物，調控靶基因表達，Smad1和Smad5是該通路中的關鍵調控蛋白，也是細胞向成骨型分化的重要蛋白。有研究表明，通過抑制Smad1和Smad5信號進而抑制成骨分化，使BMP信號不能發揮作用，說明了BMP/Smad通路在成骨中的重要性。BMP信號是OB定向分化所必需的，它們通過Smad信號誘導核心結合因子α1/成骨特異性轉錄因子2(Cbfα1/Runx2)等成骨分化的關鍵調控基因的表達，從而使細胞向OB分化。
研究發現，創傷后新生軟骨內逐漸有新生血管長入，隨后新生軟骨開始被含有成熟OB和OC的骨組織逐漸代替，而且骨化區內的OB、OC及周圍組織的新生血管內皮細胞中均有血管內皮生長因子(VEGF)表達，VEGF是誘導血管生成最有效的細胞因子，這些說明骨化過程中VEGF可能起到促進成骨的作用。眾多研究已證實AS患者VEGF表達上調，與AS病程密切相關。目前證實BMP信號在成骨定向分化過程中有重要作用，而在具成骨潛能的干細胞中BMP又與VEGF互相促進表達。大量研究已證實TNF-α作為炎癥啟動因子上調VEGF的表達，由此可以推測，TNF-α既啟動了AS炎癥，又上調VEGF的表達，高表達的VEGF通過BMP信號的作用(BMP/Smad通路)既成倍放大其自身的表達，又介導新生軟骨細胞向OB分化，從而發揮其在AS骨化中的作用。因此，炎癥可以促進AS軟骨內骨化。
此外，Wnt信號通路與BMP信號通路在成骨過程中發揮重要協同作用。在AS骨形成過程中，早期階段主要由BMP信號通路調控，在成骨的晚期階段則主要由Wnt信號通路調控，Wnt/β-連環蛋白信號通路在AS新骨形成中發揮重要作用。Daoussis等研究表明，DKK-1作為Wnt蛋白最主要的抑制劑，在AS患者中出現功能失調而使Wnt信號通路活化，導致新骨形成。Uderhardt等通過骶髂關節炎小鼠研究發現，阻斷DKK-1導致骶髂關節處的軟骨細胞肥大，加速關節強直。
此外，研究表明AS患者骨細胞不表達sclerostin蛋白(β-連環蛋白抑制劑)，支持了Wnt/β-連環蛋白經典通路在AS骨化中的作用。Las等通過進行性強直小鼠模型(ank/ank)免疫組化顯示，β-連環蛋白表達上調定位于關節軟骨細胞核內，提示Wnt/β-連環蛋白信號通路在軟骨細胞中活化，表明Wnt/β-連環蛋白信號通路促進軟骨內骨化，在AS骨化過程中發揮重要作用。Wnt/β-連環蛋白經典通路途徑為:Wnt蛋白與細胞膜上受體結合，在胞質內信號通路經糖原合成激酶、腺瘤性息肉蛋白及β-連環蛋白，調節目標基因表達，最終使間充質干細胞(mesenchymalstemcells，MSC)向OB分化。該通路與BMP信號有直接聯系，其中BMP-2可以上調β-連環蛋白表達。
綜上所述，在AS炎癥促進骨化的過程中，TNF-α發揮重要驅動作用，再通過BMP信號的成骨作用以及Wnt/β-連環蛋白信號通路與BMP/Smad信號通路的協同作用，共同促進OB的形成，引起AS骨化。AS骨化過程中除了MSC參與外，還有韌帶成纖維細胞。成纖維細胞來源于MSC，具有成骨特性，可以OB定向分化，MSC可以認為是一種原始的成骨祖細胞。多數研究表明，成纖維細胞是AS韌帶骨化發生的始動細胞。已有學者體外培養AS患者棘上韌帶成纖維細胞，觀察到其基質中沉積了大量鈣鹽顆粒，并最終發展為OB。高根德等發現，AS的成纖維細胞內膠原和鈣顆粒增多，提示其在AS病理發展過程中有重要作用。有相關研究提示，成纖維細胞在BMP的作用下可以向OB轉化，而且單獨應用BMP-2能夠誘導成纖維細胞向OB分化。此外，劉宏瀟等發現AS關節囊成纖維細胞較正常人成纖維細胞出現過度增殖現象。這些研究提示成纖維細胞的異常增殖和其向OB分化，可能是AS新骨形成的重要因素。
Lories等發現相對于正常滑膜組織，脊柱關節炎的滑膜組織中促成骨性分化因子BMP-2的表達水平明顯升高，而BMP-2促進成骨祖細胞向OB分化。徐衛東等研究證實AS患者骶髂關節滑膜細胞參與新骨形成，其分泌的成骨調節因子作用于關節成纖維細胞向OB分化，說明AS滑膜炎與新骨形成之間有聯系。據此作者認為，在AS炎癥環境中，滑膜細胞表達BMP信號，不僅可以作用于MSC，也作用于成纖維細胞，促進其向OB方向轉化，是加重AS骨化的重要因素。
綜上所述，炎癥能夠引發新骨形成，滑膜細胞由炎癥反應誘導表達成骨調節因子，促進AS韌帶骨化，其中TNF-α間接通過BMP信號可能發揮重要作用。
炎癥與骨化沒有直接聯系
通常認為AS骨化是炎性骨侵蝕后的骨重塑，屬于代償性骨質增生，而附著點應激假說持相反觀點，該假說認為附著點炎癥與新骨形成是兩個相對獨立的過程。附著點病變是AS最主要的病理變化。附著點是指韌帶、肌腱、關節囊和纖維環與骨連接的部位。整個AS附著點病變分為3個階段:早期炎癥、骨侵蝕和韌帶骨贅(新骨)形成。研究表明TNF-α是觸發AS“炎癥因子風暴”級聯瀑布效應的關鍵因子之一，它與AS韌帶骨化具有密切聯系。多項研究證實，TNF-α阻斷劑可快速緩解大多數AS病人的臨床癥狀和系統性的炎癥，但在阻斷AS韌帶骨贅形成及影像學進展的療效尚不理想。
如采用依那西普治療AS研究中發現，阻斷TNF-α不能抑制起止點處新骨形成的發生，提示炎癥與骨化在一定程度上是兩個獨立的過程。附著點應激假說認為，附著點微損傷和細胞受力激活BMP信號，一方面引起促炎癥因子的增多，導致炎性淋巴細胞遷移至附著點而引發炎癥；另一方面激活間充質干細胞，促進新骨形成。后者主要由BMP和Wnt信號通路介導而發生軟骨內骨化。該假說認為炎癥與新骨形成在分子機制上是完全獨立的，即使在疾病早期阻止炎癥，也并不能阻止后續的新骨形成。
此外，大量研究支持了炎癥與骨化在一定程度上是兩個獨立的過程這一觀點。VanderHeijde等對AS患者接受英夫利西單抗、依那西普、阿達木單抗治療2年前后的脊柱影像學積分(mSASSS)進行了比較，由于設立長達2年的安慰劑組有悖倫理，其對照組取自20世紀90年代開始的OASIS(AS國際研究中的轉歸評價)的長期觀察隊列，結果均顯示，影像學進展的平均分在TNF-α拮抗劑組與對照組間無顯著差異。由此可以看出，雖然AS炎癥得到顯著抑制，但TNF-α拮抗劑未能抑制AS的影像學進展。
Lories等通過抑制破骨細胞完全抑制炎性骨侵蝕后發現骨質增生仍然存在，抑制破骨細胞并不能預防關節強直，沒有先前的炎性骨破壞，關節強直仍可以由成骨祖細胞引起。此外，HLA-B27轉基因大鼠模型研究表明，骨質增生與炎癥和骨破壞同時發生。盡管眾多學者認為，長期抗TNF治療可以導致骨質增生，這基于由TNF-α驅動的持續性的炎癥可通過Wnt信號通路抑制新骨形成這一設想，且Baraliakos等通過長期臨床觀察發現，抗TNF治療新骨形成的發生率并沒有增加。這說明新骨的形成是獨立的，與炎癥沒有直接聯系。
最近的研究表明AS炎癥通路可能由除TNF-α之外的細胞因子介導，比如IL-1和IL-17，其中關鍵的細胞因子可以導致骨質增生。Sandborn等研究表明，IL-1β能夠通過Wnt-5a通路誘導體外人MSC向OB分化，促進骨質增生。TNF-α以兩種生物活性形式存在，即26kD的跨膜型(tmTNF-α)和17kD的分泌型(sTNF-α)，后者由TNF-α轉化酶(TACE)酶切tmTNF-α胞外段而形成。兩型TNF-α的分子結構、受體親和力以及作用方式均不同，因此，二者的功能不盡相同。van等通過觀察tmTNF轉基因小鼠模型發現sTNF和tmTNF有不同作用，后者選擇性高表達參與了AS新骨形成。據此可以認為，采用TNF-α阻斷劑對AS骨化無療效而得出炎癥與新骨形成無關聯，這樣的研究結論過于片面。因為AS炎癥反應與新骨形成都是由眾多細胞因子和信號通路組成的錯綜復雜的調控機制網絡，AS炎性通路與新骨形成重要通路之間的相互作用尚待進一步探索。
炎癥抑制新骨形成
Diarra等認為，炎癥促進骨吸收從而抑制骨形成。該研究證明持續的由TNF-α驅動的炎癥可抑制新骨形成。Heiland等發現，無骨贅形成的AS患者高表達DDK-1，提示DDK-1對于AS患者骨質增生有抑制作用。Dickkopf(Dkks)蛋白家族有4個成員，分別為DDK-1、DDK-2、DDK-3和DDK-4，均是分泌性糖蛋白，Wnt蛋白也是一類分泌型糖蛋白，它們之間存在抑制關系，其中DKK-1是Wnt蛋白最主要的抑制劑。TNF-α可上調DKK-1，從而抑制Wnt信號通路，阻止代償性骨質增生。
此外，TNF-a還能增加核因子-κB(NuclearfactorκB，NF-κB)受體活化因子配體(RANKL)表達。RANKL與破骨細胞膜上NF-κB受體活化因子(RANK)結合，促進破骨細胞形成和骨吸收。Pedersen等發現，經抗TNF-α治療后炎癥消退的患者新骨形成的概率反而增加了，說明TNF-α有抑制新骨形成的作用。NF-κB是一種具有多向性調節作用的轉錄因子，對細胞內許多基因的表達起著關鍵性的調控作用，可通過多種途徑介導炎性反應、免疫應答、氧化應激及自由基損傷。NF-κB/Rel家族成員有5種，其中，在細胞內發揮主要生理作用的是p65-p50異源二聚體，在靜息狀態時，NF-κB的p65亞基與其抑制蛋白IκB結合形成復合物，以失活狀態存在于細胞漿中，不具有調節基因轉錄的能力。
當受胞外信號刺激時，通過一個或多個信號轉導途徑，激活一系列激酶，使IκB降解，p65-p50活化并從胞質異位到胞核，與核內相應基因上的κB位點特異性結合，調節相關基因表達。NF-κB過度激活會導致多種基因，如促炎細胞因子、趨化因子、黏附分子、免疫受體、氧化應激相關酶、轉錄因子等高表達。一系列自身免疫性疾病及炎癥性疾病，如炎癥性腸病(IBD)、類風濕性關節炎(RA)、骨關節炎(OA)和血清陰性脊柱關節病(SpA)與NF-κB的異常活化有關。
目前直接描述NF-κB的活化在AS病程中作用的研究很少。但已有研究發現NF-κB在AS患者滑膜T細胞中呈活化狀態。Eggert等研究發現，在有效的TNF-α拮抗劑治療后，AS患者白介素(IL)-6、CRP(C-反應蛋白)以及p65DNA結合水平均下降，提示NF-κB在AS患者中呈現活化狀態。一系列研究表明，與其他炎性關節病相似，AS嚴重炎癥環境下，NF-κB異常活化。研究表明TNF-α是觸發AS“炎癥因子風暴”級聯瀑布效應的關鍵因子之一，同時也是NF-κB活化的主要驅動者，上游的TNF-α和NF-κB信號通路之間存在正反饋機制。
眾多研究表明，炎癥伴隨促炎細胞因子過度表達抑制成骨分化與骨形成過程。Chang等通過體內、外實驗證實，抑制NF-κB信號通路不僅能夠控制炎癥，還有助于成骨分化與骨再生，提示NF-κB可以作為控制炎癥，同時促進骨再生的新靶點；該研究同時揭示了在MSC成骨分化過程中存在Wnt信號通路與NF-κB信號通路交聯，即NF-κB通過降解β-catenin抑制MSC成骨分化，β-catenin與NF-κB活化存在抑制關系。
綜上所述，可以推測，NF-κB炎性通路的失活趨勢與AS晚期患者炎癥的下降趨勢甚至消失相一致，而NF-κB的失活有助于β-catenin的表達，從而促進AS骨化，提示在AS病程中，抑制炎癥可能促進晚期骨化過程，支持炎癥抑制新骨形成的觀點。
總結與展望
炎癥和骨化是AS發病進程中的兩個過程，以上研究在不同的側面獲得不同的結果。基于目前的證據，作者認為炎癥與骨化有一定的關聯，AS炎癥信號通路與骨化信號通路之間存在著交叉點相互作用。目前AS發病機制的探索集中于基因組學研究，而進一步深入探究AS炎癥信號通路、骨化信號通路以及兩者之間的相互作用，將有助于揭示AS炎癥與新骨形成的關系，從而進一步了解AS的發病機制，因此，蛋白質組學研究可能為AS發病機制的探索開辟新的廣闊的前景。
