CRISPR Cas9基因編輯是目前流行的基因編輯技術，其原理是利用人工設計的引導RNA（gRNA）與Cas9核酸酶結(jié)合，靶向特定基因序列進行剪切和修飾。CRISPR/Cas系統(tǒng)經(jīng)過進一步的改進和發(fā)展，將Cas9蛋白與具有脫氨酶活性的堿基修飾酶（例如APOBEC1、BE3、yABE7.10等）進行融合，則在近些年實現(xiàn)了對基因組DNA的單堿基編輯和修飾。
然而，由于難以將引導RNA遞送到線粒體中，這一方法并不適用于線粒體 DNA （mtDNA）的編輯。線粒體作為細胞中種類繁多的細胞器之一，其地位十分特殊，它不僅作為細胞的“發(fā)動機”為細胞提供能量，還參與包括細胞凋亡、細胞周期調(diào)控、免疫應答等在內(nèi)的一系列重要信號傳遞通路。線粒體還擁有自己的一套DNA，如果這套DNA出現(xiàn)異常，也可能引起多種疾病，如耳聾、視力受損、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。因此，開發(fā)能夠編輯mtDNA的基因編輯技術意義十分重大。
目前，研究人員主要使用轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應子（transcription activator-like-effector，TALE）衍生的堿基編輯器來催化mtDNA的編輯。2018年，Mougous實驗室在伯克霍爾德菌（Burkholderia cenocepacia）中發(fā)現(xiàn)了一種脫氨酶，由于能夠在雙鏈DNA上工作，因此命名為雙鏈DNA脫氨酶（Double
strand DNA deaminase，DddA）。之后，Mougous實驗室與劉如謙實驗室合作，將DddA與蛋白TALE結(jié)合，實現(xiàn)mtDNA的堿基從C到T的編輯。然而，這類堿基編輯器對序列的上下文有一定的要求，比如最初的堿基編輯器DdCBE只對跟在T之后的C有較高的編輯效率。
要突破這一局限，通常有兩種方法，其一是工程化改造原有的編輯器，其二是尋找其他種類的編輯器。2022年，劉如謙等人通過噬菌體輔助進化的方法對DdCBE進行了升級，開發(fā)出了可以編輯跟在A、T、C之后的C的堿基編輯器。然而，跟在G之后的C仍沒有適用的堿基編輯器。
近日，北京大學未來技術學院汪陽明實驗室對多個來源于微生物的與DddA同源的雙鏈脫氨酶進行了鑒定，并將其中一種成功改造成為線粒體堿基編輯器。2月16日，相關研究成果以“DddA homolog search and engineering expand sequence compatibility of
mitochondrial base editing”為題發(fā)表于Nature Communications。
圖1 研究成果（圖源：[2]）
研究的第一作者、汪陽明實驗室的博士生米黎在研究伯克霍爾德菌DddA的序列和結(jié)構時發(fā)現(xiàn)，在其羧基端（C端）包含兩個SPKK相關肽基序，其中S代表絲氨酸（Serine）、P代表脯氨酸（Proline）、K代表賴氨酸（Lysine）。它們更喜歡在雙鏈DNA的小溝中結(jié)合富含A/T的DNA序列。刪除這兩個基序?qū)⑾鼶ddA的脫氨酶活性，添加與SPKK相關基序相似的基序，使之具有類似的DNA結(jié)合特性（即偏好A/T），則能夠恢復DddA的脫氨酶活性。
圖2 SPKK相關肽基序?qū)ddA的脫氨活性十分重要（圖源：[2]）
利用這一結(jié)果，研究人員對DddA的候選同源物進行了鑒定和篩選。研究人員注意到，一種來自于Simiaoa sunii的雙鏈DNA脫氨酶（Ddd_Ss）在非TC序列上下文的情境下，具有廣泛的脫氨活性。Simiaoa sunii是一種新近在中國溫泉中被發(fā)現(xiàn)的細菌，屬于芽孢桿菌科（Bacillaceae）的一個未知屬，其命名源自于唐代醫(yī)學家孫思邈。
使用不同DNA底物進行脫氨測定的結(jié)果證實，Ddd_Ss在面對緊跟著A、G、C或T之后的胞嘧啶殘基都可以有效脫氨。這代表利用Ddd_Ss開發(fā)mtDNA 堿基編輯器將有望補上先前無法對緊跟G后的C進行編輯的缺口。
圖3 Ddd_Ss對A、G、C或T之后的胞嘧啶殘基都可以有效脫氨（圖源：[2]）
基于此，研究人員開發(fā)了開發(fā)了源自Ddd_Ss的DdCBE，并實現(xiàn)了對來自 10 個線粒體基因的14 個mtDNA位點的高效編輯。另外值得注意的是，通過從Ddd_Ss引入單個氨基酸到伯克霍爾德菌的DddA，研究人員成功提高了基于后者的堿基編輯器的活性和序列相容性，這為之后開發(fā)新的線粒體堿基編輯器提供了指導意義。
這項研究對于當前mtDNA編輯技術實現(xiàn)了可以在GC上下文進行編輯的突破，同時還對拓展線粒體堿基編輯器的序列兼容性指出了參考方向。但需要注意的是，基于Ddd_Ss開發(fā)出的堿基編輯器仍然存在廣泛的脫靶問題。未來，還需要更復雜的設計來實現(xiàn)mtDNA高效和高度特異性兼顧的堿基編輯。
責編|風立宵
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參考資料：
