【摘要】 目的 探討腎清飲抑制腎間質纖維化的可能機制。方法 采用腺嘌呤灌胃法建立大鼠腎間質纖維化動物模型，并給予腎清飲和鹽酸苯那普利干預治療，作腎臟病理學檢查，并以免疫組化和RTPCR方法分別檢測大鼠腎臟轉化生長因子β1(TGFβ1)、金屬蛋白酶組織抑制物1(TIMP1)的表達。結果 各腎清飲干預組腎組織腎間質纖維化程度輕于模型對照組，免疫組化和RTPCR檢測的腎臟TGFβ1、TIMP1的表達量均少于模型對照組(P<0.05)。結論 腎清飲可通過減少腎組織TGFβ1、TIMP1的表達，抑制腎間質纖維化的進展。
【關鍵詞】 腎清飲;腎間質纖維化;轉化生長因子β1;金屬蛋白酶組織抑制物1
ABSTRACT: Objective To study the possible mechanism of Shenqingyins inhibiting renal interstitial fibrosis. Methods Renal interstitial fibrosis in rats was induced by intragastric administration of adenine, and then the rats underwent Shenqingyin and Lotensin intervention. Finally we made the pathological examination of renal tissues, used immunohistochemistry and RTPCR to observe the expressions of transforming growth factorβ1 (TGFβ1) and tissue inhibitor of metalloproteinase1 (TIMP1) in renal tissues. Results The degree of renal interstitial fibrosis was milder in Shenqingyin group than in model control group. Immunohistochemistry and RTPCR results showed that Shenqingyin intervention group had lower expressions of TGFβ1 and TIMP1 than model control group (P<0.05). Conclusion Shenqingyin can inhibit renal interstitial fibrosis by decreasing the expressions of TGFβ1 and TIMP1 in the kidney.
KEY WORDS: Shenqingyin; renal interstitial fibrosis; transforming growth factorβ1 (TGFβ1); tissue inhibitor of metalloproteinase1 (TIMP1)
腎間質纖維化是各種原因引起的腎臟疾病持續進展并最終發展成為終末期腎病的共同途徑和主要病理基礎[1]。腎間質纖維化的治療藥物種類較多，但療效并不滿意。中藥腎清飲的臨床觀察結果顯示，該藥能有效地保護腎功、延緩腎衰竭的進展。本研究通過建立腺嘌呤灌胃致大鼠腎間質纖維化模型，給予中藥腎清飲干預治療，觀察腎清飲對腎組織轉化生長因子β1 (transforming growth factorβ1, TGFβ1)及金屬蛋白酶組織抑制物1(tissue inhibitor of metalloproteinase1, TIMP1)的影響，探討腎清飲抗腎間質纖維化的部分機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、主要試劑及藥品 雄性SD大鼠56只，體重180～200g，清潔級，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供。造模試劑藥品：腺嘌呤(Amerisco公司);腎清飲(黃芪、當歸、川芎、藏紅花、大黃、芍藥、地龍等中藥組成)，制成水煎濃縮液，每毫升含生藥2.4g，4℃冰箱保存備用;鹽酸苯那普利(北京諾華制藥有限公司)。ET1放免試劑盒(北京科美東雅生物技術有限公司)。RTPCR試劑：總RNA提取Trizol試劑(Invitrogen公司)，逆轉錄試劑盒及Taq DNA聚合酶(Fermentas/MBI公司)。引物設計：①3磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)上游5′CATAGACAAGATGGTGAAGG3′，下游5′TCCACAGTCTTCTGAGTGGC3′，570bp;②COLⅠ上游5CCTACAGCACGCTTGTGGAT3，下游5′ATTGGGATGGAGGGAGTTTA3′，193bp;③COLⅢ上游5′TCAAGAGCGGAGAATACTGG3′，下游5′TATGTAATGTTCTGGGAGGC3′，295bp;④TGFβ1上游5′AGCCTGCTTCTTGAGTC3′，下游5′AGGAAAGGTAGGTGATA3′，241bp。引物由上海生物工程公司合成。
1.2 動物分組和標本采集 56只SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組、腎清飲預防組、腎清飲低劑量組、腎清飲高劑量組、鹽酸苯那普利組、腎清飲+鹽酸苯那普利組，共7組，每組8只，其中后5組統稱藥物干預組。腺嘌呤：腺嘌呤用20g/L淀粉懸液配成，灌胃劑量250mg/(kg·d);腎清飲(低)：按生藥折算每100g大鼠體重灌胃腎清飲1g/d;腎清飲(高)：按生藥折算每100g大鼠體重灌胃腎清飲3g/d;鹽酸苯那普利：鹽酸苯那普利灌胃10mg/(kg·d)。造模過程中正常對照組、腎清飲低劑量組、腎清飲+鹽酸苯那普利組各死亡大鼠1只，模型組死亡2只。6周結束前1d，將大鼠置于代謝籠中收集24h尿液。6周結束時乙醚麻醉大鼠，下腔靜脈采靜脈血，取雙腎，部分置于40g/L多聚甲醛固定，部分液氮凍存。
1.3 病理染色及免疫組化檢測 固定于40g/L多聚甲醛的腎組織，經脫水，包埋，切成4μm的切片，進行HE、Masson病理染色，并行SABC法免疫組化染色檢測TGFβ1及TIMP1，操作按照說明書進行;采用德國LeicaQwin550CW圖像信號采集分析系統進行圖象分析，系統對圖象進行灰度轉化并自動測量，測量值越高表明相應蛋白表達越低，反之則越高。
1.4 RTPCR 取液氮中的腎組織，按照Trizol試劑說明提取總RNA，取2μg總RNA按照逆轉錄試劑盒要求合成cDNA，取適量cDNA作為模板分別加入GAPDH、TGFβ1、TIMP1引物，在Taq DNA聚合酶催化下進行PCR，取8μL PCR產物在15g/L瓊脂糖凝膠上電泳，美國SYNGENE全自動凝膠分析儀觀察并照相，同一塊凝膠內參照GAPDH亮度值設為100，讀取目標斷片相對亮度值。
2.1 腎組織HE及Masson染色結果 正常對照組未見病理改變。模型對照組大鼠腎臟肥大、顏色蒼白、表面凹凸不平，呈細顆粒樣。鏡下均出現了典型的腎小管間質損害，單位視野腎小球、腎小管比重減少，間質比重增加，伴大量炎細胞浸潤;腎臟內可見棕褐色結晶沉積，周圍伴有間質纖維化改變;腎小管上皮細胞腫脹，散在腎小管壞死、灶狀萎縮;部分腎小管有囊狀擴張或代償肥大，可見蛋白管形和細胞管形;腎小球病變相對較輕。腎清飲干預的各組及鹽酸苯那普利干預組大鼠腎臟病理改變類似于模型組的改變，但各種病變程度都明顯輕于模型對照組，且以腎清飲預防組最輕。
2.2 腎組織中TGFβ1、TIMP1的表達 正常對照組大鼠腎臟僅有極少TGFβ1、TIMP1表達。模型對照組和各藥物干預組的腎小管上皮細胞胞質、間質細胞、小球系膜細胞均可見TGFβ1、TIMP1的棕黃色顆粒，且以模型對照組陽性染色區最多最深，腎清飲預防組陽性染色區最少最淺。免疫組化半定量結果統計分析顯示，TGFβ1、TIMP1各藥物干預組表達顯著多于正常對照組(P<0.01)，而顯著少于模型對照組(P<0.01)，各藥物干預組之間，腎清飲預防組表達少于其他藥物干預組(P<0.01)。腎清飲低劑量組、腎高劑量組、鹽酸苯那普利組和聯合用藥組之間TGFβ1表達沒有統計學差別(P>0.05)。腎清飲低劑量組和鹽酸苯那普利組TIMP1表達高于腎清飲高劑量組和聯合用藥組(P<0.05);腎清飲低劑量組和鹽酸苯那普利組TIMP1表達沒有統計學差別(P>0.05)。腎清飲高劑量組和聯合用藥組TIMP1表達沒有統計學差別(P>0.05，表1)。表1 各組腎組織中TGFβ1、TIMP1的半定量分析與各治療組對比，*P<0.01;腎清飲低劑量組和其他治療組對比，△P<0.01。
2.3 腎組織TGFβ1、TIMP1mRNA的表達情況 各藥物干預組TGFβ1、TIMP1mRNA表達量顯著高于正常對照組(P<0.01)，而顯著低于模型對照組(P<0.01)。各藥物干預組之間，腎清飲預防組TGFβ1、TIMP1mRNA表達量低于其他藥物干預組(P<0.05)。鹽酸苯那普利組TGFβ1表達量高于聯合用藥組(P<0.05)。而腎清飲低劑量組、腎清飲高劑量組、鹽酸苯那普利組、聯合用藥組相互之間TIMP1表達量沒有統計學差別(P>0.05，表2、圖1、圖2)。表2 各組腎臟TGFβ1、TIMP1mRNA表達情況的比較與各治療組對比，*P<0.01;腎清飲預防組和其他治療組對比，
3 討 論
腺嘌呤灌胃大鼠能形成典型均一的腎間質纖維化改變，在發病機制、病理改變及臨床表現等方面與人類間質性腎炎特別是尿酸性腎病類似。因此，該模型是研究腎間質纖維化和慢性腎功能衰竭的發病機制和預防治療的較好動物模型[2]。腎間質纖維化是以細胞外基質在腎間質的過度積聚為特征，Masson染色能反映腎間質中膠原纖維的多少。本實驗Masson染色顯示腎清飲干預各組和鹽酸苯那普利治療對照組腎組織膠原沉積均少于模型組，提示腎清飲具有抗腎間質纖維化作用，具有和ACEI類藥物鹽酸苯那普利相似的作用。
目前，認為腎間質纖維化是一個動態的過程，涉及到多種細胞的活化、多種細胞因子和血管活性物質、細胞外基質的生成失衡等諸多因素[3]。TGFβ1是目前最為公認的致纖維化細胞因子之一。它從多個方面促進細胞外基質(ECM)的合成，并抑制ECM的降解，導致ECM過度積聚，組織纖維化[47]。TIMP能與基質金屬蛋白酶(MMP)不可逆結合，從而阻止MMP對ECM的降解，造成ECM的產生和降解失衡，間質發生纖維化[811]。本實驗中無論是免疫組化還是PTPCR方法檢測的腎組織TGFβ1和TIMP1的表達量，腎清飲干預的各組低于模型對照組。以上提示減少腎組織TGFβ1和TIMP1的表達是腎清飲防治腎間質纖維化的部分可能機制。而在腎清飲高劑量組、低劑量組、鹽酸苯那普利、聯合用藥組之間的TGFβ1、TIMP1的表達，在免疫組化的蛋白水平和PTPCR的mRNA水平上未形成完全相同的結果，其原因推測可能是該兩種方法都是采用了半定量方法，以及從核酸到蛋白的轉錄翻譯過程復雜，及實驗誤差等因素造成。
腎清飲預防組大鼠腎臟病理纖維化改變明顯輕于其他各藥物干預組，且腎臟TGFβ1、TIMP1的表達量低于其他藥物干預組，提示早期應用腎清飲，防治腎間質纖維化的療效更佳。
腎清飲主要由黃芪、當歸、川芎、藏紅花、白術、地龍、大黃等組成，具有益氣補血、活血通絡的作用。現代中醫藥研究發現黃芪、當歸、川芎、大黃等具有改善微循環、抗血小板積聚、和調節免疫等作用，抑制腎組織和其他器官纖維化的進展?？傊?，腎清飲可以通過減少腎組織TGFβ1、TIMP1的表達實現抗腎間質纖維化的作用。本研究為腎清飲的臨床應用提供初步實驗支持，并為將來進一步研究腎清飲提供初步的實驗基礎。
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