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近日，兩個(gè)卵子結(jié)合產(chǎn)生后代的研究一經(jīng)發(fā)表，立即引起熱議，很多男性開(kāi)始擔(dān)心自己的“生殖地位”會(huì)下降。事實(shí)上，男性的半邊天在一連串打擊下飽受壓力：Y染色體的消失、克隆動(dòng)物的出現(xiàn)以及兩個(gè)卵子可產(chǎn)生后代。雄性動(dòng)物會(huì)被“忽略”嗎？

沒(méi)有“爸爸”的小雌鼠。供圖：李勁松

文｜葉水送

兩個(gè)卵子的結(jié)合，居然成功產(chǎn)出健康的幼鼠，整個(gè)過(guò)程無(wú)需雄性參與。這一顛覆了人們對(duì)生殖認(rèn)識(shí)的研究成果，11月17日發(fā)表在科學(xué)期刊Cell Rsearch上，引發(fā)媒體持續(xù)地關(guān)注。

這項(xiàng)研究是上海生化與細(xì)胞研究所研究員李勁松在單倍體細(xì)胞系研究領(lǐng)域的又一次突破。很多人擔(dān)心這一技術(shù)會(huì)使用在人類(lèi)身上。對(duì)此，李勁松表示，“強(qiáng)烈反對(duì)利用這種技術(shù)來(lái)制造人類(lèi)后代”。

中國(guó)科學(xué)院上海生化與細(xì)胞研究所研究員李勁松

- 令人著迷的單倍體細(xì)胞系 -

單倍體細(xì)胞系研究一直讓各國(guó)科學(xué)家著迷。這是因?yàn)橥ㄟ^(guò)單倍體細(xì)胞克隆的個(gè)體是研究者研究生命奧秘的理想模型，研究者可針對(duì)單倍體細(xì)胞進(jìn)行基因編輯。由此產(chǎn)生的表型直接體現(xiàn)在幼鼠身上，極大地提高了基因編輯的效率。

李勁松對(duì)這一領(lǐng)域的興趣并非一時(shí)興起，當(dāng)年還在洛克菲勒大學(xué)做博后的他，面臨著抉擇：回國(guó)后是繼續(xù)他博后進(jìn)行的嗅覺(jué)神經(jīng)方面研究，還是從事他從本科到博士一直進(jìn)行的干細(xì)胞研究。經(jīng)歷一番掙扎后，李勁松繼續(xù)他所熱愛(ài)的胚胎發(fā)育與細(xì)胞重編程研究。

對(duì)于很多低等生物來(lái)說(shuō)，如酵母、蕨類(lèi)植物等，它們可以以單倍體的形式存活。但對(duì)于高等生物來(lái)說(shuō)，單倍體只存在其成熟后形成的配子中，如精子和卵子。從嚴(yán)格意義上來(lái)講，卵子也是雙倍體，因?yàn)樗挥性谑芫螅艜?huì)將第二極體排出形成單倍體。單倍體細(xì)胞只有一套染色體，降低了基因組的復(fù)雜程度，在遺傳分析、基因功能與性狀研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，因而單倍體細(xì)胞是生命科學(xué)研究的窗口以及重要工具。然而如何獲得高等動(dòng)物的單倍體細(xì)胞系研究，一直困擾著這一領(lǐng)域的各國(guó)科學(xué)家。

2012年，李勁松和徐國(guó)良合作通過(guò)將精子注入去核的卵母細(xì)胞中建立小鼠的類(lèi)精子單倍體細(xì)胞系，成功與小鼠的卵細(xì)胞結(jié)合，產(chǎn)生具有穩(wěn)定遺傳性狀的幼鼠。這項(xiàng)具有突破性的研究發(fā)表在Cell雜志上。

“2012年發(fā)表這項(xiàng)研究時(shí)，Cell雜志的編輯也認(rèn)為，建立一個(gè)可培養(yǎng)的類(lèi)精子單倍體細(xì)胞系，從概念到技術(shù)都很新穎。”李勁松表示。

事實(shí)上，無(wú)論是人類(lèi)還是小鼠，從精原干細(xì)胞到最后在附睪加工成成熟的精子這一過(guò)程非常復(fù)雜，精子一旦成熟，結(jié)構(gòu)功能特化，而且不會(huì)再分化，如果在體外能建立一個(gè)類(lèi)精子單倍體細(xì)胞系，并且能代替精子與卵子結(jié)合形成受精卵，意義會(huì)很大。

同年，中科院動(dòng)物研究所研究員周琪、趙小陽(yáng)也利用小鼠的精子與去核的卵細(xì)胞結(jié)合形成孤雄單倍體細(xì)胞，再與卵細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合，產(chǎn)生出健康的小鼠。該研究發(fā)表在Nature雜志上。

盡管半克隆小鼠的研究結(jié)果令人振奮，但是如何將這項(xiàng)技術(shù)從概念向工具轉(zhuǎn)化仍有阻力。研究者發(fā)現(xiàn)半克隆小鼠出生效率很低，僅為4.5%，且將近一半的幼鼠出現(xiàn)發(fā)育不良的現(xiàn)象。

2013年一整年，李勁松實(shí)驗(yàn)室一直在尋找解決這個(gè)問(wèn)題的關(guān)鍵。最終他們發(fā)現(xiàn)，雄性印記基因H19在半克隆小鼠中高表達(dá)，是導(dǎo)致小鼠出生率低、發(fā)育遲緩的關(guān)鍵因素。當(dāng)研究者修復(fù)基因H19的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)半克隆小鼠的出生率顯著提高，但是發(fā)育失敗率仍然很高。后來(lái)發(fā)現(xiàn)另一雄性印記基因Gtl2同樣過(guò)表達(dá)，于是研究者再將這個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)行修復(fù)，結(jié)果小鼠的出生率達(dá)到了20%。這一結(jié)果顯示，兩個(gè)雄性印記基因的過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致小鼠發(fā)育率低以及發(fā)育異常。

至于半克隆小鼠為何全都是雌鼠，李勁松表示，精子分為兩種，或攜帶X染色體，或攜帶Y染色體，它們進(jìn)入卵子后分別產(chǎn)生雌性和雄性個(gè)體。但是，所有的單倍體干細(xì)胞，不管是精子來(lái)源，還是卵子來(lái)源，全部都是攜帶X染色體的，所以利用單倍體干細(xì)胞產(chǎn)生的半克隆小鼠均是雌性。

李勁松進(jìn)一步解釋?zhuān)琗染色體上有上千個(gè)基因，對(duì)細(xì)胞的生存有著至關(guān)重要的作用，細(xì)胞如果沒(méi)有X染色體是不能存活的，因此不可能從Y染色體的精子中產(chǎn)生單倍體細(xì)胞系，后代自然不會(huì)出現(xiàn)半克隆的雄性個(gè)體。目前的研究發(fā)現(xiàn)，這些半克隆小鼠能夠健康長(zhǎng)大成年并具有生育能力，至于這些小鼠未來(lái)是否存在其它方面的健康隱患，目前還不得而知。

- 當(dāng)半克隆技術(shù)遇到CRISPR/Cas9 -

2013年，李勁松課題組的一篇文章顯示，通過(guò)直接向攜帶白內(nèi)障遺傳缺陷的小鼠受精卵中注入CRISPR/Cas9系統(tǒng)后，即可編輯受精卵的基因達(dá)到修復(fù)遺傳缺陷的目的。但是，當(dāng)時(shí)的修復(fù)效率只有30%，且經(jīng)過(guò)基因編輯的受精卵存在少量的脫靶。

為了解決這兩個(gè)問(wèn)題，2014年，李勁松課題組與北京大學(xué)湯富酬實(shí)驗(yàn)室和上海生化與細(xì)胞研究所吳立剛實(shí)驗(yàn)室合作，利用CRISPR/Cas9在白內(nèi)障小鼠精原干細(xì)胞中進(jìn)行遺傳修復(fù)并建立一系列的精原干細(xì)胞系，通過(guò)嚴(yán)格分析，選擇修復(fù)的并且不攜帶任何脫靶的精原干細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)移植，用于產(chǎn)生健康的雄性配子，從而實(shí)現(xiàn)后代100%不攜帶白內(nèi)障遺傳缺陷。隨著半克隆技術(shù)和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的日趨成熟，通過(guò)兩種技術(shù)的結(jié)合進(jìn)行小鼠疾病模型建立或者遺傳疾病的治療研究變得更簡(jiǎn)單。

李勁松認(rèn)為，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)改造生殖細(xì)胞主要有兩個(gè)策略，一是編輯受精卵，二是編輯生殖單倍體細(xì)胞（配子），編輯生殖單倍體細(xì)胞更具前景，因?yàn)樗茉谂渥咏Y(jié)合成受精卵之前進(jìn)行篩查，從而保障配子的基因改造準(zhǔn)確性大大提高，減少CRISPR/Cas9技術(shù)由于脫靶帶來(lái)的弊端。正由于CRISPR/Cas9技術(shù)目前還存在脫靶問(wèn)題，因此他反對(duì)目前將該技術(shù)使用在人類(lèi)生殖細(xì)胞基因修飾上。“這會(huì)存在很大的風(fēng)險(xiǎn)”，李勁松表示。

- 雄性會(huì)逐漸被“忽略”嗎? -

兩個(gè)卵子結(jié)合產(chǎn)生后代的研究一經(jīng)發(fā)表，立即引起人們的熱議，很多男性開(kāi)始擔(dān)心自己的地位會(huì)下降。事實(shí)上，男性的半邊天在一連串打擊下飽受壓力：Y染色體的消失、克隆動(dòng)物的出現(xiàn)以及兩個(gè)卵子可產(chǎn)生后代。雄性動(dòng)物真的會(huì)被“忽略”嗎？

1600萬(wàn)年前，X、Y染色體同時(shí)出現(xiàn)，擁有相同的長(zhǎng)度，但隨后Y染色體不斷縮短，截至目前其僅為X染色體長(zhǎng)度的1/3。澳大利亞拉籌伯大學(xué)（La Trobe University）研究員詹妮弗·格拉芙（Jennifer Graves）甚至給出Y染色體450萬(wàn)年后很有可能會(huì)消失的論斷，雄性動(dòng)物的地位似乎岌岌可危。

自然法則似乎也印證了格拉芙這一令人不安的結(jié)論：一種生活在日本的田鼠，在進(jìn)化過(guò)程中竟將自己的Y染色體弄丟，好在它們?cè)诩?xì)胞的常染色體上重新找到新的性別決定基因，如果不是這樣，那么它們只會(huì)落入進(jìn)化終結(jié)的死胡同里，繼而滅絕，從這個(gè)星球上消失。它們的現(xiàn)在或許是人類(lèi)的未來(lái)嗎？

正如我們所知，很多動(dòng)物的繁殖需要精卵結(jié)合才可孕育下一代，但對(duì)于低等生物個(gè)體而言，它們采取無(wú)性生殖，即可大量繁衍后代，從而迅速建立種群優(yōu)勢(shì)。稍微高等的一些動(dòng)物，它們會(huì)采取無(wú)性和有性生殖結(jié)合的繁殖策略，當(dāng)食物豐盛、氣候適宜時(shí)，它們會(huì)把精力放在快速增殖上，采取無(wú)性生殖策略，當(dāng)天氣開(kāi)始變冷，環(huán)境惡劣時(shí)，雌性個(gè)體通常會(huì)尋覓雄性個(gè)體進(jìn)行有性生殖，從而產(chǎn)生健壯的后代以度過(guò)艱難時(shí)刻。脊椎動(dòng)物營(yíng)有性生殖，繁殖下一代需兩性結(jié)合。

自從克隆動(dòng)物出現(xiàn)后，這一規(guī)則受到嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。1996年，英國(guó)愛(ài)丁堡大學(xué)科學(xué)家伊恩·維爾穆特（Ian Wilmut）利用細(xì)胞核移植技術(shù)，在全球首次克隆出大型哺乳動(dòng)物——克隆羊“多莉”，“多莉”沒(méi)有父親，它是維爾穆特利用一只羊的乳腺細(xì)胞的細(xì)胞核與另外一只羊的去核卵細(xì)胞結(jié)合誕生的，它是人類(lèi)第一次真正意義上利用“無(wú)性生殖”的方式產(chǎn)生出的哺乳動(dòng)物，隨后貓、狗、豬、牛等動(dòng)物相繼被克隆出來(lái)。

顛覆人們對(duì)生殖的認(rèn)識(shí)的科學(xué)研究似乎沒(méi)有停止的意思。李勁松研究組這項(xiàng)發(fā)表在Cell Research雜志上的研究顯示：兩個(gè)卵子也能產(chǎn)生出健康的后代。研究人員通過(guò)在卵子中建立攜帶基因修飾的單倍體細(xì)胞系，然后再將這些細(xì)胞與另一只雌鼠的卵細(xì)胞結(jié)合，之后可高效地產(chǎn)生出健康的小鼠出來(lái)。

至于兩個(gè)精子是否產(chǎn)生后代，李勁松在接受媒體采訪時(shí)如是回答，“精子比卵子小得多、簡(jiǎn)單得多。卵子有可能被改變成精子，但反過(guò)來(lái)就會(huì)困難得多。”

- 單倍體細(xì)胞系的未來(lái)應(yīng)用 -

事實(shí)上，科學(xué)家持續(xù)開(kāi)展的單倍體細(xì)胞系的研究對(duì)生命科學(xué)的基礎(chǔ)研究、人類(lèi)疾病研究的意義遠(yuǎn)大于人們對(duì)于雄性個(gè)體地位可能被“忽略”的擔(dān)憂。

2015年上半年，李勁松實(shí)驗(yàn)組成功建立了“類(lèi)精子細(xì)胞”的單倍體細(xì)胞系，它們能穩(wěn)定地與雌鼠的卵細(xì)胞結(jié)合，產(chǎn)生出半克隆小鼠。由于小鼠研究在人類(lèi)健康以及癌癥等方面具有很大的參考價(jià)值，這些具有穩(wěn)定遺傳的“類(lèi)精子細(xì)胞”的單倍體細(xì)胞系自然意義非凡。

單倍體細(xì)胞系的建立，未來(lái)有望作為一個(gè)工具來(lái)使用，研究者可進(jìn)行多基因的敲除或者敲入實(shí)驗(yàn)。例如，研究者對(duì)三個(gè)基因的同時(shí)表達(dá)感興趣，可以通過(guò)把這些基因敲入單倍體干細(xì)胞中，然后通過(guò)卵子注射獲得攜帶三基因同時(shí)敲入的半克隆小鼠。

事實(shí)上，人類(lèi)的疾病大多數(shù)也是由多基因突變或缺失引起，如果將這些突變基因敲入到單倍體細(xì)胞體系中，那么人們就能很好地建立人類(lèi)疾病的小鼠模型，通過(guò)對(duì)小鼠的表型研究，有助于人們了解這類(lèi)疾病的發(fā)生以及發(fā)展。以往科學(xué)家都是基于細(xì)胞水平研究人類(lèi)多基因介導(dǎo)的疾病，很難做到個(gè)體水平的研究，現(xiàn)在已經(jīng)可以通過(guò)哺乳動(dòng)物的個(gè)體模型來(lái)研究人類(lèi)的疾病特征。

在采訪結(jié)束時(shí)，李勁松表示，下一步的主要工作是在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物身上建立能代替精子使用的單倍體細(xì)胞系，從而可以通過(guò)注入卵子獲得半克隆猴子，進(jìn)而更好地研究人類(lèi)的疾病。

致謝：感謝李勁松老師對(duì)本文的修正。

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3. Wu Y, Zhou H, Fan X, Zhang Y, Zhang M, Wang Y, Xie Z, Bai M, Yin Q, Liang D, Tang W, Liao J, Zhou C, Liu W, Zhu P, Guo H, Pan H, Wu C, Shi H, Wu L, Tang F & Li J. Correction of a genetic disease by CRISPR-Cas9-mediated gene editing in mouse spermatogonial stem cells. Cell Research. 2015.

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5. Yang H, Liu Z, Ma Y, Zhong C, Yin Q, Zhou C, Shi L, Cai Y, Zhao H, Wang H, Tang F, Wang Y, Zhang C, Liu X, Lai D, Jin Y, Sun Q & Li J. Generation of haploid embryonic stem cells from Macaca fascicularis monkey parthenotes. Cell Research. 2013.

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