失眠是世界難題，影響著所有年齡段的人。調查顯示，全球總人口的30%受輕度失眠的影響，約10%患有嚴重或慢性失眠。失眠的原因和機制很復雜，可能是其他重大軀體疾病和精神疾病的癥狀，以及使用、濫用或暴露于某些物質。同時，越來越多研究證明，腸道微生物群會干擾宿主的胃腸道生理，代謝和免疫功能，并通過微生物群 - 腸道 - 大腦（MGB）軸影響中樞神經系統（CNS）功能和行為。腸道微生物群的微妙失衡與許多人類疾病有關，例如睡眠不足，晝夜節律錯位，情感障礙和代謝疾病。
成人腸道中存在大約1，000種類型的微生物群，一項研究數據顯示，體重70公斤的'標準人'有3.9×1013腸道中的細菌，細菌與人類細胞的比例為1：1。在另一項研究中，據報道，每個糞便樣本中平均有762，655個腸道細菌基因，表明基因數量是人類基因組的38倍。上述數字突顯了腸道菌群代謝能力的重要性。許多研究已經確定，腸道微生物群通過產生雙向通信的各種途徑影響大腦功能。最近的研究表明，生物鐘錯位和睡眠剝奪會改變生物鐘基因表達和微生物群落結構。
使用中草藥治療失眠可以追溯到2000多年前。百合（LB)是一種常見的藥用物種，該植物是中國龍徽縣的地理標志產品。LB的鱗莖被稱為'白鶴'，白鶴連子湯、枸杞白鶴湯等以LB為主要原料的湯，在中國人中用于緩解失眠。在臨床實踐中，白鶴被中醫生直接用作治療失眠的中藥，并記錄在中華人民共和國藥典中（Munafo and Gianfagna 2015）。
LB在臨床上已被長期用于治療失眠，但其機制仍未得到探索。本研究采用腹腔內（ip）PCPA誘導的失眠大鼠模型。檢測失眠大鼠下丘腦相關神經遞質、對應受體和病理，采用16S核糖體RNA（16S rRNA）基因測序聯合超高效液相色譜-質譜/質譜（UPLC-MS/MS）綜合分析LB對PCPA誘導失眠大鼠腸道微生物群和糞便代謝表型的影響。
在Wistar大鼠腹膜內注射對氯苯丙氨酸（PCPA）誘導失眠模型。將大鼠分為3組:對照組、PCPA (400 mg/kg，灌胃2天)、LB(598.64 mg/kg，灌胃7天)。觀察下丘腦5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、褪黑素(MT)水平、GABAA、5-HT1A、MT受體的表達及病理變化。采用16S rDNA測序和UPLC-MS/MS技術檢測腸道菌群和代謝變化。
結果顯示，對照組和PCPA組大鼠的體重變化存在差異(圖1)。與PCPA組相比，LB組的體重增加顯著增加。
如圖2（A-C）所示，PCPA給藥顯著降低了下丘腦的5-HT和MT水平（p <0.05），并增加了NE的水平（p<0.01）。每天口服LB（598.64mg / kg）7天，使5-HT和MT水平顯著增加（p <0.01）和NE水平降低。
如圖3（A-C） 所示，對照組下丘腦神經細胞不僅豐富且形狀良好，而且分布均勻，而PCPA組的神經細胞嚴重變形，排列不緊密，并且有許多破碎的小細胞。值得注意的是，在LB組中，細胞排列整齊，萎縮細胞的數量顯著減少。
如圖4(A-C)所示，PCPA處理顯著減少了下丘腦5-HT和GABAA R的表達(p <0.01)，但MT的表達無顯著變化。口服LB (598.64 mg/kg)超過7天，顯著的增加 5-HT1A、GABAA R和MT的表達(p <0.01)。
我們對16S rRNA基因的V3-V4可變區進行了測序。以97%的序列相似度為臨界值，將高質量序列聚類為51，342個操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs)。在LB組中，OTU秩豐度在橫軸上的斜率較平緩，分布較寬，說明添加LB后腸道菌群更加多樣化，分布更加均勻(圖5(A))。同時，接近平臺的稀疏曲線表明測序深度含有罕見的新系統型和大多數多樣性(圖5(B,C))。Chao1的估計值反映了細菌群落的生態物種豐富度，突出了物種數量，而Shannon指數與物種分布呈正相關。Chao1指數平均為3539.91比2901.54（p <0.01）（圖5（B）），Shannon指數平均值為7.84 vs. 7.11（p<0.05）(圖5(C))， LB組均高于PCPA組。
在OTU水平上，計算了兩組樣本之間的差異和相似性（圖6（A）)。與PCPA組（4725）菌群多樣性的降低相比，在LB添加后植株多樣性顯著增加（5220），趨向于正常組（5324）。PCoA分析表明，LB組的群落組成與PCPA組分離（圖6（B）)。
分類單元總結揭示了LB干預后腸道微生物組成的顯著變化。在屬水平上，10個區系在PCPA組與對照組之間存在顯著差異(圖6(C))。與對照組相比，PCPA組紫單胞菌科（18.92%，p <0.01），瘤胃球菌科（6.46%，p <0.01），梭狀芽胞桿菌（1.35%，p<0.05）的百分比顯著下降，而乳酸菌（14.02%，p <0.01），普氏菌（7.85%，p <0.05），大腸埃希菌（8.15%，p <0.01），擬桿菌（1.81%，p <0.01）和薩特氏菌（1.26%，p <0.05），布勞特氏菌（1.06%，p <0.05），副擬桿菌（0.81%，p<0.05）顯著增加。 同時，5個菌群在屬水平上LB組與PCPA組之間存在顯著差異(圖6(C))。與PCPA組相比，LB組紫單胞菌（28.83%，p<0.05）、毛螺菌（14.06%，p<0.05）和羅氏菌（4.26%，p<0.01）的百分比顯著增加，而乳酸菌（6.13%，p<0.01）和大腸埃希菌（1.27%，p <0.01）的比例明顯下降。
根據OPLS-DA模型，LB組的代謝特征與PCPA組的代謝特征有顯著差異，但往往與對照組相似，表明PCPA引起的改變在LB添加后明顯緩解。在PCPA和LB組中差異表達的代謝物以火山圖（圖7（C，D）)顯示。
為了鑒定PCPA和LB組之間的代謝產物差異，我們選擇了PCPA和LB組中變化倍數為≥1.5（上調）或≤0.5 (下調）的代謝產物。這些從OPLS-DA模型中篩選出VIP≥1的代謝產物。最后從所有樣本中篩選出662個代謝產物(圖7(C,D))。其中，131個代謝物在PCPA處理后上調，65個代謝物下調(圖7(C))。與PCPA組相比，LB組有33個代謝產物表達上調，65個代謝產物表達下調(圖7(D))。這些代謝物被分為20多個不同的類，但主要是有機酸及其衍生物、核苷酸及其代謝物、氨基酸及其代謝物、氧化脂類、碳水合物及其代謝物、脂類其他磷脂、苯及其取代衍生物、酚類及其衍生物、脂類等。如圖7(E、F)所示，在PCPA和LB組中，前10種差異代謝物分別呈上調(紅色標記)和下調(綠色標記)。在這些總差異代謝物中，與PCPA組相比，LB組中共有37種代謝物顯著下調或上調(表1)。
隨后使用KEGG對所有差異代謝物進行了富集分析。研究表明，PCPA誘導的代謝產物主要與花生四烯酸代謝、色氨酸代謝、原代膽汁酸生物合成、不飽和脂肪酸生物合成、血小板活化等有關（圖8（A）)。與PCPA組相比，LB改變的差異代謝物主要與抗葉酸耐藥性、花生四烯酸代謝、嘌呤代謝、色氨酸代謝、TRP通道的炎癥介質調節等有關（圖8（B）)。
為了深入了解腸道微生物群的分布是否與代謝特征相關，我們使用Spearman相關性分析分析了顯著不同的屬級菌群和差異代謝物之間的相關性（|r|> 0.7）。如熱圖（圖 9）所示，總共 33 種差異代謝物與 LB 組中 28 種腸道菌群中的一種或多種呈正相關或負相關。其中，LB處理后趨向正常的代謝產物有（±）9-HETE，（±）12-HETE，15-氧代ETE，1-甲基尿酸，2-氨基己二酸，8，9-EET，生物喋呤，d-果糖，DHA，犬尿酸，l-肉堿，l-棕泡蝶呤，泛醇，磺胺嘧啶，色胺，黃嘌呤。
綜上，LB逆轉了大鼠腸道菌群和糞便代謝表型多度和多樣性的不良變化，并且改善了下丘腦細胞的病理現象。PCPA改變最顯著的花生四烯酸代謝和色氨酸代謝途徑受到LB的顯著調控。此外，還發現LB降低了與精神疾病相關的犬尿酸和與心血管疾病相關的三甲胺-N-氧化物的水平。
總之，LB可以通過改善PCPA引起的腸道菌群和代謝物的紊亂來緩解失眠，作為一種藥用和食用草藥，LB可以考慮作為保健食品進行開發，以緩解未來日益增加的失眠癥。
原文來源：
Yanpo Si, et al. A comprehensive study on the relieving effect of Lilium brownii on the intestinal flora and metabolic disorder in p-chlorphenylalanine induced insomnia rats.PHARMACEUTICAL BIOLOGY 2022, VOL. 60, NO. 1, 131–143
https://doi.org/10.1080/13880209.2021.2019283
