非編碼 RNA（ non-coding RNA,ncRNA） 是生物體內普遍存在，且對生命活動具有重要調控作用的生物分子[1]. 環狀 RNA（ circular RNA,circRNA） 是廣泛且多樣地存在于多種生物細胞中，具有調控基因表達作用的一類內源性 ncRNA 分子。 對 circRNA的逐步認識不僅豐富了競爭性內源 RNA（ competingendogenous RNA,ceRNA） 的調節網絡，而且為我們深入研究一些疾病的發生發展機制和治療手段提供了新方向。
1 circRNA 的發現
circRNA 最早于 20 世紀 70 年代在 RNA 病毒中被發現[2,3]. 1990 年，人們利用雙向凝膠電泳和電鏡等技術在一種釀酒酵母（ Saccharomyces） 真菌中觀察到了 circRNA 分子的蹤跡。 這是一種缺少 5'和 3'末端的 20S RNA,具有與丁型肝炎病毒（ hepatitis Dvirus,HDV） 相似的特性[4]. 在隨后的幾十年，人們從一些轉錄本中也發現了一些由外顯子構成的circRNA,如結腸直腸癌缺失基因（ delete in colorectalcarcinoma gene,DCC） 轉錄本[5]、人類 Ets-1 基因（ E-Twenty-Six-1,Ets-1） 轉錄本[6]、性別決定基因（ sexdetermining region Y,SRY ） 轉錄本[7]、細胞色素P450 2C24 基因轉錄本[8]和環狀 INK4 基因座反義非編碼 RNA （ circular antisense non-coding RNA inthe INK4 locus,cANRIL）[9]等，但當時它們被認為是轉錄的"噪音",未引起人們太多的關注。
近年來，隨著生物信息學技術的快速發展，circRNA 這一類古老且具有保守特征分子的神秘面紗逐漸被揭開[10]. Salzman 等[11]發現了數以百計的與人類基因表達相關的 circRNA. Jeck 等[12]在人類成纖維細胞中檢測到了高達 25 000 多種 circRNA.Memczak 等[13]則從 RNA 測序數據中鑒定出 1 950種人類 circRNA,1 903 種小鼠 circRNA 和 724 種線蟲 circRNA. Guo 等[14]發現了與多種人類細胞系相關的 39 種生物樣本中的 7 112 種 circRNA. 目前發現的 circRNA,根據其在基因組中的來源及其構成序列的不同，可以分為以下 3 類： 外顯子來源的環形RNA 分子 （ exonic circRNA）[11-13,15],內含子來源的環形 RNA 分子（ circular intronic RNA,ciRNA）[16]和由外顯子和內含子共同組成的環形 RNA 分子（ retained-intron circRNA）[17].
circRNA 具有 以下特征： 1 ） 表達水平差異較大[10,11]; 2） 不易被核酸外切酶 RNase R 降解[11,12];3） 具有序列保守性[10,11]; 4） 偏好于細胞漿中[15]; 5）外顯子來源為主； 6） 屬于 ncRNA; 7） 可充當 ceRNA的角色調控靶基因的表達； 8） 在轉錄或轉錄后水平發揮調控作用[15].
2 circRNA 的主要功能
現有的研究表明，circRNA 在轉錄及轉錄后水平具有非常重要的基因表達調控作用（ Fig. 1） ,而且，它們通常還呈現組織或發育階段的特異性表達。
2. 1 具有 miRNA 海綿作用
哈佛醫學院 Salmena 等[18]于 2011 年 7 月提出了著名的 ceRNA 調控假說。 該假說認為： ceRNA 的生物 學 功 能 是 通 過 miRNA 應 答 元 件 （ miRNAresponse element,MRE） 完成的，ceRNA 具有數量和種類不等的 MRE,可以競爭性地結合 miRNA,降低miRNA 對其靶標的抑制作用，也就是 miRNA 的海綿作用。 circRNA 上存在多個 miRNA 的互補結合位點，可海綿般吸收 miRNA,以減少 miRNA 對靶基因的負性調控。 同時，因為 circRNA 缺乏多聚（ A） 尾和 5'末端，可逃脫脫腺苷、脫帽和降解等[19],所以在充當 miRNA 海綿方面具有明顯的優勢[13,20]. 具有代表性的 circRNA 有小腦退化相關蛋白 1 反義轉錄物 （ antisense to the cerebellar degeneration-relatedprotein1 transcript,CDR1as） 和 SRY 的反義鏈。
CDR1as 由 Hansen 等[21]于 2011 年首次發現。它定位于胞漿中，主要在人和小鼠腦中表達[13,20],含有 74 個 微 小 RNA-7 （ microRNA-7,miR-7） 的MRE,遠遠多于目前已知的"線性海綿". 它是miR-7的環狀抑制劑，對 miR-7 起到負調控作用[22]. 因此，CDR1as 又 被 稱 為 miR-7 的 環 狀 RNA 海 綿（ circular RNA sponge for miR-7,CiRS-7）[22]. 目前還沒有發現其它 circRNA 能與 CDR1as 的 miRNA 海綿效果相媲美[14]. 當 CDR1as 高表達時，它能大量結合 miR-7 而導致 miR-7 靶標的表達水平同步增加； 而當 CDR1as 低表達時，miR-7 靶標的表達水平也同步降低[18]. Memczak 等[13]在對斑馬魚的研究中發現，運用 3-氨丙基嗎啉敲低 miR-7 表達水平或應用表達人或小鼠線性或環狀 CDR1as 序列的質粒轉入斑馬魚胚胎中，均可引起中腦容量減少。 但是在注入 miR-7 的前體后，中腦容量的減少能夠得到挽救，充分說明了 CDR1as 對 miR-7 的海綿作用。
Hansen 等[21]研究發現，miR-671 能與 CDR1as 完全互補并觸發 CDR1as 的裂解，說明 miR-671 能通過抑制 CDR1as 間接調控 miR-7 的表達。研究證實，SRY 基因外顯子的反向重復序列可轉錄成 circRNA 分子[23 -25]. Hansen 等[21]研究發現，SRY 基 因 相 關 的 睪 丸 特 異 性 circRNA 具 有 與CDR1as 類 似 的 功 能，它 擁 有 miR-138 的 16 個MRE,可調控 miR-138 的表達水平。
2. 2 調控基因轉錄Zhang 等[16]鑒定出一種來源于基因內含子區域的 circRNA,發現這種 ciRNA 分子在細胞核內含量豐富，可參與基因轉錄調控。 其中具有代表性的為錨蛋白重復結構域 52（ ci-ankyrin repeat domain 52,ci-ankrd52） ,它大部分定位于轉錄位點附近，并可以影響 RNA 聚合酶 II 復合體的延長，是聚合酶 II 復合體的正調節因子，對其母系基因發揮順式調控作用。 沉默信息調節因子 7（ silent information regulator7,ci-sirt7） 也具有類似的作用機制[16].
INK4 / ARF 位點相關的長鏈非編碼 RNA-ANRIL 通過結合 PcG 復合物抑制了編碼基因 INK4 /ARF 的轉錄，該位點同時編碼了 cANRIL,推測它也可能具有轉錄調控功能[9].
2. 3 調控 RNA 結合蛋白。研究顯示，有些 circRNA 分子可以吸附蛋白質因子。 如 CDR1as 和 Sry 可與 miRNA 效應因子阿格蛋白（ argonaute,AGO） 相結合[13,20],從而被切割或者抑制翻譯，最終被降解； 而 ci-ankrd52 與 RNA 聚合酶 II 復合體相互作用可影響該酶的活性，最終調節轉錄[16]. 另外，Bohjanen 等[26]設計了一種能夠特異 地 結 合 反 式 激 活 調 控 蛋 白 （ transactivatingregulatory protein,Tat） 的 circRNA 分子，從而抑制 1型人類免疫缺陷病毒 1 （ human immunodeficiencyvirus type 1,HIV-1） 基因的表達。
2. 4 參與蛋白質翻譯。大多數 circRNA 存在于胞質中[27],提示它們可以被裝載到核糖體而被翻譯成多肽。 與許多沒有 5'帽和 3'多聚（ A） 尾的線性 mRNA 相似，circRNA 也缺乏有效的翻譯起始結構，但是一旦啟動了一個內部核糖體進入位點 （ internal ribosome entry site,IRES） ,兩者都是可以被翻譯的[14]. 丁型肝炎病毒（ hepatitis D virus,HDV） 的核心包含有單股負鏈共價閉合 circRNA 分子，它編碼的相關蛋白 HDV 抗原（ hepatitis D virus antigen,HDAg） 在疾病發展中起到了重要的作用[28]. 另外，研究者發現，人骨肉瘤細胞 U2OS 中，circRNA 具有翻譯功能，盡管其翻譯效率非常低[14]. 但是，隨著越來越多核糖體分析數據的獲得，circRNA 在其它細胞類型或物種中是否能被翻譯是一個值得深入研究的課題[14].
另外，Talhouarne 等[29]發現，熱帶爪蟾的卵母細胞核含有大量的 ciRNA,大多是 1000 nt 的長度，耐核酸外切酶 RNase R,且胞漿內的含量明顯多于胞核的含量。 在受精卵發育過程中，ciRNA 可傳給子代，顯示它在 RNA 介導的遺傳和表觀遺傳中發揮了重要的作用。
3 circRNA 與疾病的關系
隨著對 circRNA 結構及功能的逐步認識，人們發現它們在疾病的發生及發展中發揮了重要的作 用[9,22,28,30-56]（ Table 1） .
3. 1 circRNA 與腫瘤
腫瘤是機體在各種致癌因素作用下，組織細胞在基因水平失去對其生長的正常調控，導致其克隆性異常增生而形成的異常病變。 腫瘤發病機制復雜，對其發病機制的研究是醫學的重大課題之一。如前所述，CDR1as 能間接調控 miR-7 靶標的表達，CDR1as/miR-7 可以通過多種途徑影響腫瘤的發生和發展[22]（ Fig. 2） . miR-7 直接作用的一些靶標是癌癥相關信號通路中的重要癌癥相關蛋白，如： 表皮生長因子受體 （ epidermal growth factor receptor,EGFR）[30]、胰島素受體 底 物 1 （ insulin receptorsubstrate-1,IRS-1 ）[30]、IRS-2[30]、p21 蛋白活化激酶-1 （ p21-activated kinase-1, Pak1 ）[31]、癌 基 因Raf1[32]、活化的 CDC42 激酶 1 （ activated CDC42kinase 1,Ack1）[33]和磷脂酰肌醇-3 激酶催化亞基 δ（ phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit δ，PIK3CD）[34]等。
在膠質瘤細胞株中，miR-7 能有效抑制 EGFR的表達，同時通過抑制蛋白激酶 B（ protein kinase B,PKB） 降低 IRS-1 及 IRS-2 的表達水平，從而降低其活力及侵襲性[30]. Pak1 是絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶中的一種，內源性 miR-7 與 Pak1 的表達水平成負相關，與同源結構域轉錄因子 HOXD10 的水平呈正相關。 在乳腺癌低侵襲表型至高侵襲表型轉化過程中，Pak1 蛋白水平逐步上調，而 miR-7 及 HOXD10逐步下調。 在高侵襲性乳腺癌細胞中，miR-7 可抑制其增殖活性、侵襲性及致瘤潛能。 顯示 miR-7/Pak1通路在乳腺癌發生過程中具有重要的作用[31]. 在肺癌、乳腺癌及膠質母細胞瘤細胞株中，Webster等[32]發現 miR-7 顯著降低 EGFR 相關 mRNA 的表達，基因芯片進一步發現癌基因 Raf1、PKB 及細胞外信號調節激酶 1/2 的下降。
在神經鞘瘤細胞中，Ack1 是 miR-7 的直接作用靶標，且兩者的表達成反比[33]. 在肝癌細胞中，PIK3CD 是 miR-7 的直接作用靶標，且兩者的表達成反比； 在體外實驗中，miR-7的過表達通過磷脂酰肌醇 3-激 酶（ phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K） /Akt 信號通路參與肝癌細胞的周期阻滯和細胞遷移，且 Akt、哺乳動 物 雷 帕 霉 素 靶 蛋白 （ mammalian target ofrapamycin,mTOR） 靶標和 p70S6K 表達下降[34]. 腫瘤干細胞（ cancer stem cell,CSC） 在腫瘤的進展及轉移中扮演了重要的角色[35]. 研究證實，miR-7 是CSC 中減少最多的 miRNA[36]. Kruppel 樣因 子 4（ Kruppel like factor 4,KLF4） 是 CSC 中 4 大轉錄因子之一。 miR-7 的抑癌作用部分可歸因于其伴隨對KLF4 的去抑制，這在乳腺癌腦轉移中發揮了重要的調節作用[36]. 另外，miR-7 通過胰島素樣生長因子 1受體（ insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R） 和局灶黏附激酶間接上調鈣黏附素導致上皮間質轉化（ epithelial-to-mesenchymal transition,EMT） 的下降，從而延緩了腫瘤的生長及轉移，這在胃癌、鱗狀細胞癌、乳腺癌和惡性膠質瘤發生過程中發揮了重要的作用[37 -40]. miR-7 可通 過調控細胞凋亡相關基因---B 淋巴細胞瘤-2 （ B-cell lymphoma-2,BCL-2）的表達來抑制人非小細胞肺癌 A549 細胞的生長[41]. 雖然大量的證據證實了 miR-7 具有抑癌作用，但是相反的作用也有報道，如在結直腸癌中，miR-7 是下調最多的 miRNA,它以癌基因 YY1 轉錄因子為靶基因，最終導致 p53 的失活[42]. 但是，在結直腸癌組織中 CDR1as 的表達水平明顯上升[43].在表達 miR-7 的肺癌 CL1-5 細胞株中，miR-7 的水平與裸鼠移植瘤的體積增大和裸鼠生存率的下降成正相關[44]. 另外，在宮頸癌和肺腺癌細胞株中，抑制 miR-7 分別顯示了增殖的下降和凋亡的上升，提示高表達的 miR-7 不一定是抑制腫瘤發生的有利因素[45]. 另外，腎癌細胞的侵襲 和增殖等被認為與miR-7 的高表達有關[46].Bachmayr-Heyda 等[43]在結直腸癌的研究中顯示，在腫瘤組織中一些 circRNA 與線性 RNA 的比例（ circ0817/CUL5; circ3204/USP3; circ6229/METTL3; circ7374 / TNS4） 較正常組織低，而在結直腸癌細胞株中則更低，這提示 circRNA 的豐度與腫瘤的增殖指標成負相關。
3. 2 circRNA 與動脈粥樣硬化
動脈粥樣硬化是一組常見且最重要的動脈硬化性血管病。 2010 年，Burd 等[9]發現，cANRIL 表達受人類 INK4a/ARF 轉錄本調控，且與人類動脈粥樣硬化風險相關。 這種影響與剪切位點的單核苷酸多態性相關，它可影響轉錄抑制因子多梳家族（ polycombgroup,PcG） 介導 INK4a / ARF 位點的表達抑制作用，從而影響動脈粥樣硬化的發生。 對 cANRIL 表達的進一步研究可望用于預防或治療動脈粥樣硬化。
3. 3 circRNA 與神經系統疾病
小腦退化相關蛋白 1 （ cerebellar degeneration-related protein 1,CDR1 ） 與小腦退化相關蛋白 2（ cerebellar degeneration-related protein 2,CDR2） 是浦肯野氏細胞（ Purkinje's cell） 抗原。 自 20 世紀 80年代末以來，CDR1 及 CDR2 基因被認為與自身免疫神經系統紊亂密切相關。 CDR1as 是 CDR1 的環狀天然反義轉錄物（ natural antisense transcript,NAT） ,最早發現表達于腦組織，尤其是小腦，這與近年分析CDR1as 的圖譜結果相符。 通過分析各種腫瘤來源細胞株中 miRNA 的表達情況，顯示 miR-7 在神經母細胞瘤中廣泛表達[47]. miR-7 也可直接調控 α-突觸核蛋白（ α-synuclein） 的表達，被認為在帕金森病發病機制中發揮了一定的作用[48].
一些含量豐富的 ciRNA 可以作為在細胞核內針對反式激活反應 DNA 結合蛋白 43 （ trans-activation responsive DNA binding protein-43,TDP43） 和其它 RNA 結合蛋白的"分子海綿",在特定的環境下通過反式作用調節基因的表達。 最近的研究顯示，在肌萎縮性脊髓側索硬化（ amyotrophiclateral sclerosis,ALS） 模型中，去除核脫分支酶后，一些內含子來源的套索狀結構聚集在細胞漿中，通過降解 TDP43 而抑制其毒性[49]. 為此，我們可以認為一些 ciRNA 在 ALS 的發病過程中起了重要的作用。
3. 4 circRNA 與糖尿病
糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。
2009 年，Correa-Medina 等[50]發現，miR-7 在胰腺的發育和分化過程中均起著重要的作用。 胰腺 β 細胞的凋亡是 1 型和 2 型糖尿病以及移植后的胰島喪失的主要原因。 在成人胰腺 β 細胞中，miR-7 抑制劑可誘導 mTOR 信號通路在增殖中的后續刺激效應[51]. 提示 miR-7 是胰腺 β 細胞更新低的可能原因，在糖尿病的發生中發揮了重要的作用，有望成為糖尿病治療的靶點[51].
3. 5 circRNA 與朊病毒病
朊病毒?。?prion disease） 是人類和動物致死性中樞神經系統退行性疾病，包括瘋牛?。?bovinespongiform encephalopathy,BSE） 、羊癢?。?scrapie） 、鹿慢性消耗性疾病（ chronic wasting disease,CWD） 、水貂傳染性腦?。?transmissible mink encephalopathy,TME） 及人的克-雅氏病 （ creutzfeldt-jakob disease,CJD） 和庫魯?。?kuru） 等[52]. 絕大部分朊病毒疾病具有傳染性，其特征在于由朊蛋白（ prion protein,PRNP） 基因編碼搔癢型或致病型朊病毒 （ scrapieprion protein,PrPSc） 在腦內蓄積，它是細胞型朊蛋白（ cellular prion protein,PrPC） 的同分異構體，在氨基酸序列上具有一致性[52]. 從生物化學的角度來講，與 PrPC 不同，PrPSc 因富含 β 折疊結構，具有去污劑不溶性和抗蛋白酶降解[53]. 2009 年，Satoh等[53]利用 KeyMolnet 生物信息學工具，揭示了 PrPC及其相互作用蛋白的復雜分子網絡，發現它們與AKTJNK 和 MAPK 信號通路顯著相關。 為了進一步識別人類細胞中受 PrPC 調控的基因，Satoh 等[54]利用位點特異性重組技術建立了一種 P1 指定穩定表達 PrPC 的人胚腎 HEK293 細胞系，利用微陣列在12 814 個基因中確定了 P1 和母系朊蛋白非表達細胞株間表達差異的 33 種基因，進一步利用 Northern印跡分析，驗證了 P1 腦特異性蛋白磷酸酶 2A 調節性 β 亞 基 （ protein phosphatase 2A,regulatory βsubunit B,PPP2R2B） （ 它是脊髓小腦共濟失調 12致病相關基因相關表達產物） 和 CDR1 基因與副腫瘤性小腦變性相關，并且發現 PrPC 的高表達可促進CDR1as 的表達。 這些結果表明，PrPC 可能參與了CDR1as 的調控，揭示了 CDR1as 在朊病毒病中的作用是值得研究的方向[19].
3. 6 circRNA 與病毒性肝炎
丁型肝炎病毒（ hepatitis D virus,HDV） 基因組是一條反義單股負鏈閉合 circRNA 分子，直徑約 36nm,含有約 1 780 個 nt,是已知感染動物最小的病毒。 HDV 能產生丁型肝炎病毒抗原（ hepatitis Dvirus antigen,HDAg） ,它有 2 種形式： 大 HDAg （ 27kD） 和小 HDAg（ 24 kD） . 它們在 HDV 感染過程中發揮不同的作用，小 HDAg 在感染的早期階段產生，進入細胞核，并支持病毒復制； 大 HDAg 與此相反，在感染的晚期階段生產，抑制病毒復制。 HDV 被認為是一種"缺陷病毒",只有在感染乙型肝炎病毒（ hepatitis B virus,HBV） 情況下才能傳播[55]. HDV的感染分為兩種情況： 一種是 HBV 和 HDV 同時感染（ coinfection） ,另一種是慢性乙型肝炎或乙肝攜帶者狀態的基礎上重疊感染（ superinfection） ,它們較HBV 單獨感染患者更容易引起嚴重的并發癥，如肝衰竭、肝硬化及肝癌[56].
3. 7 circRNA 與疾病的治療
基因敲除、反義寡核苷酸和 miRNA 海綿是使miRNA 功能喪失的 3 種經典方法[57]. 基因敲除動物模型的構建是耗時、昂貴和困難的。 化學修飾的反義寡核苷酸在短期實驗是有用的，但是無法實現miRNA 的長期抑制。 miRNA 的海綿技術被認為有可能替代基因敲除技術的一種新型技術[58]. 當miRNA 海綿被轉染入人細胞中，它們抑制 miRNA靶標的強度與反義寡核苷酸具有同等效力。 針對致癌基因的海綿能夠逆轉人類腫瘤細胞的惡性表型[59]. 人工海綿是 RNA 治療中強有力的手段[60],隨著近年來多種線性海綿的發現，circRNA 海綿也初現端倪。 如 Liu 等[61]運用 T4 噬菌體基因 td 自身剪切所構建的針對 miR-21 及 miR-221 的 circRNA海綿導入黑色素瘤細胞株中，結果發現，circRNA 較線性 RNA 分子顯示了出眾的抗癌效果。 顯示circRNA 在疾病治療中具有廣闊的前景。
4 問題與展望
隨著對 RNA 調節網絡研究的深入，circRNA 在其中發揮的作用逐步凸顯。 最近的研究顯示，circRNA 將超越線性 RNA 分子，成為下一代的"miRNA 海綿". 針對這類 RNA 分子的鑒定和功能研究，不僅豐富了我們對真核生物轉錄組的認識，而且對于如腫瘤、動脈粥樣硬化及糖尿病等常見、多發及難治性疾病的發病機制及治療手段的研究提供了新的方向，如探索 circRNA 在疾病發生中的作用機理、作為分子標記物的診斷價值及在疾病治療中的作用等。 我們相信，隨著對 circRNA 的進一步研究，在后基因組時代將為我們開啟一扇基因及疾病研究的大門。
