腦脊液(CSF)檢查
病毒性腦炎(viral encephalitis，VE)是常見的中樞神經系統感染性疾病，是病毒入侵神經系統及相關組織引起的炎性或非炎性的改變。臨床表現為精神行為異常、抽搐、發熱及神經系統定位體征等。各型VE的診斷技術有許多共同點，但目前普遍缺少病原學與基因組學的診斷方法。快速準確的診斷方法是臨床上治療VE的指南針，近年來有關該病的診斷方法的研究有很大進展。
腦脊液(CSF)檢查
CSF檢查在VE診斷中是一種常規輔助檢查方法，在與其他腦炎鑒別中至關重要。除有明確腰穿禁忌證外，臨床懷疑腦炎者均應行腰穿查CSF。
1.1 細胞計數 根據福克斯羅森塔爾計數室研究，為避免細胞過多裂解，總細胞計數與白細胞計數應在CSF采集后2h內進行。成年人VE的典型CSF特點為白細胞正常或輕度增高，白細胞計數為(50-500)×10^6/L，偶見>1000×10^6/L，其中以淋巴細胞增多最為顯著。嬰兒VE白細胞計數多無固定值，其隨著年齡增加逐漸增大。在感染急性期白細胞增高以中性粒細胞為主，但因就診時常已錯過此期而臨床上少見。部分單純皰疹病毒性腦炎(herpes simplex virus encephalitis，HSE)急性感染期白細胞數多在正常范圍，之后逐漸升高。腸病毒感染所致VE的CSF中白細胞計數早期亦可正常，之后數天內逐步上升。
1.2 糖及氯化物 VE患者CSF中糖和氯化物一般正常，但巨細胞病毒(CMV)、西尼羅河病毒、皰疹病毒等少數病毒感染時糖含量可減少。
1.3 蛋白質 VE患者的CSF中蛋白質水平在正常范圍或輕度升高，但一般不超過0.5-1.0g/L。
1.4 細胞培養 如果條件允許，應常規進行CSF細胞培養，以確定病毒株。此法敏感性低，特異性高，易出現假陰性結果，故在臨床上診斷VE時應結合其他相關檢查綜合考慮。也可在適當時間取咽拭子、糞便及水皰中的液體或病變拭子進行培養，但這些取材和CSF中細胞含量較少，很難達到細胞培養的要求，故臨床上很少應用。
腦電圖(electroencephalogram，EEG)
EEG是診斷本病的重要依據之一。它是腦實質受累的指標，可顯示大腦早期病變，通常在影像學檢查顯示腦實質病變前就能出現異常信號，通過EEG可觀察到大腦局部異常，但其特異性不高。如EEG頻率變慢(常為4-9Hz)并出現陣發性慢波、尖波或棘波，則提示病情較重。
病原學檢查
3.1 病毒分離 此方法目前被認為是VE病原學診斷的金標準，其優點是特異性高，但操作過程復雜，成功率低，且需要患者的配合與理解，臨床很難普及。
3.2 病毒特異性抗體檢測 單純皰疹病毒1、2型(HSV-1、HSV-2)，水痘病毒(VZV)，CMV，人類皰疹病毒6、7型(HHV-6、HHV-7)，EB病毒(EBV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，人類免疫缺陷病毒(HIV)，腺病毒(adenovirus)，流感病毒A、B(influenza virus A、influenza virus B)，輪狀病毒(rotavirus)，柯薩奇病毒(coxsachie virus)和副流感病毒(parainfluenza virus)均可通過酶免疫測定(enzyme immunoassay，EIA)在血清和CSF中被檢測到。
酶聯免疫吸附試驗(ELlSA)用于檢測病毒抗體，成功率較高。但該實驗抗體常為重組蛋白，常因受細菌污染而影響檢測結果的準確性。隨著ELISA方法的改良，其檢測敏感性有所提高，可以用于大規模血清學篩查。
蛋白質印跡法(Western blot)在多種病毒感染性疾病的診斷中被作為確診實驗，并用于識別血清和CSF中的特異性抗體。因其抗原敏感性低于新一代ELISA檢測病毒抗體，故在VE診斷中未成為首選診斷技術。
3.3 病毒抗原檢測 HSV，VZV，RSV，流感病毒A、B，副流感病毒1、3以及腺病毒的抗原均可通過傳統的免疫熒光(IF)法對其咽拭子標本進行抗原檢測。但此方法不適用于CSF標本，因為CSF中抗原含量較低，很難被檢出。
免疫組織化學(IHC)是檢測組織中抗原的常用方法，廣泛應用于定性實驗，可通過顯微鏡直觀的看到組織中是否存在相關抗原，其效果穩定。
新型ELISA方法基于雙抗體夾心模式，也可應用于病毒檢測。2001年Bode等報道用該方法檢測博爾納病病毒(Borna disease virus，BDV)的磷蛋白(p24)和核蛋白(p40)的構象表位。該方法檢測BDV抗原具有較高敏感性和特異性，并保持了ELISA法的高穩定性、操作方便的優點，也可以試用于檢測其他病毒。
3.4 聯合檢測 三聯-ELISA檢測即特異性循環免疫復合物(CIC)、相關游離抗體和血漿抗原的檢測。Bode等的研究揭示BDV-CIC、相關游離抗體和血漿抗原(p40/p24)檢測相同樣本陽性率的差異。該研究發現檢測CIC陽性率明顯高于抗體和抗原的陽性率，表明此病毒在機體內通過抗原-抗體免疫反應后大多形成CIC，以CIC形式引發機體的免疫反應，這可能也解釋了BDV持續感染的免疫機制。此方法檢測感染陽性率比單純血清學檢測高10倍以上，可能是現代病原學診斷的一個新趨勢。
基因組學診斷
基因組學在病毒性疾病的研究和診斷中的應用越來越廣泛，為診斷VE開辟了傳統病原學診斷方法以外的新途徑，特別是聚合酶鏈反應(PCR)技術的高敏感性和高特異性，使VE的診斷技術有更大的進步。基因診斷是利用DNA分析技術，直接從基因水平(DNA或RNA)檢測患者的基因缺陷。2011年福建省對引起VE的腸道病毒Echo30進行了反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)序列分析鑒定Echo30血清型，測定并分析其擴增產物的序列。結果顯示其擴增產物的序列與不同地區、時間的流行株的基因序列進行比較發現3個位點氨基酸出現了變異。近來有研究發現血管內皮細胞生長因子(VEGF)的 405G/C位點多態性與VE的易感性有關。PCR技術是最便捷的核酸檢測方法。隨著其應用范圍逐漸擴大，實驗種類從最初的RT-PCR增加到與其他各項技術相結合而發展起來的巢式反轉錄熒光定量PCR(FQ-nRT-PCR)、實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR)、多重RTPCR(multiplex PCR)等多種方法。
PCR是擴增DNA的方法之一，用于RNA檢測時需先將RNA轉錄成互補的DNA。常規RT-PCR分反轉錄和cDNA擴增兩個步驟進行，一步法RT-PCR則是在RTPCR基礎上進一步改進，該方法在同一反應體系中，同時進行反轉錄及PCR反應，從樣品RNA提取、反轉錄、PCR擴增到電泳觀察的全部過程可在短時間內完成，并且可以精確、快捷地擴增出目的片段，適合大規模推廣。但檢測時要注意反應溫度，較低溫度可使RNA形成二級結構而降低RT-PCR檢測率。
FQ-nRT-PCR技術檢測病毒基因片段具有諸多優點，如特異性高、靈敏性高、穩定性好、重復性好、操作簡便和快捷等。它克服了RT-PCR只能定性不能定量、容易污染而產生假陽性、需通過電泳觀察結果以及溴化乙啶對人體有害等缺點。此外，其在病毒復制水平及抗病毒治療療效評估方面具有重要臨床價值。
實時熒光定量PCR以敏感性高、特異性高、污染少、可定量等優點著稱，其中目前常用于檢測各種病毒主要有Taq Man探針法和SYBR Green I染料法。SYBR Green I是一種雙鏈DNA結合染料，它結合到雙鏈DNA后可使其熒光強度增加1000倍以上，從而保證熒光信號增加與PCR產物增加同步。Taq Man real-time PCR優勢在于利用上、下游引物及與目的模板互補的探針使反應特異性具有雙重保證，克服了SYBR Green I法存在假陽性的缺陷，從而使檢測結果更加可靠。
影像學檢查
影像學檢查是VE診斷的重要輔助手段。它能夠及早發現VE病灶及其侵犯范圍，為早期診斷和治療提供直觀依據。目前常用的影像學檢查方法主要是MRI和CT。MRI準確率及敏感性較CT高，但MRl要求患者高度配合，偶爾的抽動都會對影像質量產生較大影響，因此對于不易控制抽動的小兒，CT是首選檢查。
VE的好發部位主要是額、顳、枕葉的近皮層區，有時可同時累及灰白質。CT檢查主要表現為病變區平掃呈低密度灶，MRI主要表現為病變區的長T1及長T2信號。增強掃描CT與MRI均為呈線狀及條片狀強化居多。治療后如強化的區域減少，則提示病情好轉。近年來，MRI擴散加權成像(diffusiong weighted imaging，DWI)、磁共振波譜(1H MRS)和磁敏感加權成像(SWI)的應用對VE診斷提供了更多依據。Sawlani曾對45例確診VE患者行DWI檢查，結果顯示在VE急性期表現為病灶范圍和異常彌散程度的多樣性，且均表現為高信號。
總之，通過樣本檢測抗原、抗體和免疫復合物為VE提供了診斷依據，通過分子生物學技術在CSF和血液中檢測病毒的應用，為VE提供了病原學依據。另外，多重分析、基因芯片和微流體技術的廣泛使用，也可能為未來診斷VE提供更簡便的方法。盡管如此，VE的病原學與基因組學診斷仍然充滿挑戰。希望今后能出現更有效的病原學診斷方法，以更好的明確診斷。
中國神經免疫學和神經病學雜志 2013年3月第20卷第2期
作者：黃藝婧 徐平（遵義醫學院附屬醫院神經內科）
