惡性腫瘤不僅是一種基因病，也是一種能量代謝性疾病。即使在氧供應(yīng)充分的條件下，腫瘤細胞也主要以糖酵解獲取能量，稱之有氧糖酵解或“Warburg效應(yīng)”，這種腫瘤細胞的糖酵解異常會促進葡萄糖攝取和乳酸生成，從而有利于腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前，“Warburg效應(yīng)”作為腫瘤的一個典型標志已被廣泛認可。2011年，Robert A.Weinberg教授在Cell雜志發(fā)表綜述，將腫瘤異常的代謝表型列入腫瘤十大特征之一【1】（下圖）。近年來，人們幾乎在所有腫瘤中都證實了Warburg效應(yīng)的存在，靶向“Warburg效應(yīng)”的腫瘤治療藥物正在火熱開發(fā)中。
十余種編碼糖酵解關(guān)鍵酶的基因直接負責(zé)調(diào)控Warburg效應(yīng)。轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控糖酵解關(guān)鍵酶基因以及調(diào)控Warburg效應(yīng)中發(fā)揮著直接且關(guān)鍵的作用【2】。例如缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)、c-Myc、NF-kB、p53等【3】。
HIF-1α是Warburg效應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子，通過與糖酵解基因啟動子上的缺氧反應(yīng)元件（hypoxia-responsive elements, HRE）結(jié)合來促進糖酵解基因的表達。c-Myc能夠直接轉(zhuǎn)錄激活編碼葡萄糖轉(zhuǎn)運體1 (GLUT1)和乳酸脫氫酶 (LDHA) 的糖酵解基因，并促進異常糖酵解。p53腫瘤抑制因子通過直接抑制GLUT1和GLUT4基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制葡萄搪攝取和乳酸產(chǎn)量【3】。然而，目前報道的調(diào)控Warburg效應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子只有少數(shù)幾個，Warburg效應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制在很大程度上仍不清楚。
北京時間農(nóng)歷正月初一凌晨，軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所葉棋濃課題組在Cancer Cell雜志上以Articles的形式發(fā)表了題為“Transcriptional Regulation of the Warburg Effect in Cancer by SIX1”的研究論文，該研究發(fā)現(xiàn)SIX1是一個新的調(diào)控Warburg效應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，SIX1調(diào)控糖酵解的功能夠直接被miR-548a-3p抑制，首次將miR-548a-3p/SIX1軸與Warburg效應(yīng)和腫瘤生長聯(lián)系起來，并闡明了相關(guān)作用機制。
轉(zhuǎn)錄因子SIX1是器官形成的關(guān)鍵調(diào)控因子，SIX1敲除的小鼠胚胎存在著多器官發(fā)育缺陷、較野生型小鼠個頭小的現(xiàn)象，而且SIX1敲除小鼠在出生后不久就死亡【4】。SIX1在多種腫瘤中高表達，例如乳腺癌、前列腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等。SIX1高表達的患者臨床預(yù)后較差【5】。SIX1能夠促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。然而，SIX1是否調(diào)控腫瘤Warburg效應(yīng)未見報道。
在最新的這項研究中，研究人員利用穩(wěn)定敲低SIX1的乳腺癌ZR75-1細胞與對照細胞進行轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq），結(jié)合實時定量PCR技術(shù)，發(fā)現(xiàn)SIX1能夠影響糖酵解通路。接下來，在SIX1 Knock Out（KO）的乳腺癌、SIX1 Knock Down（KD）的肝癌細胞系中均證實了SIX1能夠促進GLUT1、HK2、PFKL、ALDOA、GAPDH、PGK1、ENO1、PKM2、LDHA 九個糖酵解關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄和表達。SIX1基因回補實驗也證實了這一點。在SIX1 KO小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）、KO小鼠胚胎以及胚胎中分離出的肝、腸、肺等組織中觀察得到相似的結(jié)果（下圖）。以上均提示，SIX1是一個調(diào)控糖酵解基因轉(zhuǎn)錄與表達的關(guān)鍵因子。那么，SIX1是如何調(diào)控這些糖酵解基因的轉(zhuǎn)錄呢？
由于之前報道的ChIP-seq和ChIP-on-chip數(shù)據(jù)結(jié)果提示，SIX1與DNA結(jié)合的特征模序為TCAG/TG，數(shù)據(jù)庫結(jié)果也顯示SIX1直接結(jié)合于6個糖酵解基因（PFKL, ALDOA, PGK1, ENO1, PKM2和LDHA）的啟動子上。為了研究SIX1如何具體調(diào)控糖酵解基因的轉(zhuǎn)錄，研究人員尋找了受調(diào)控的糖酵解基因啟動子上游近3 kb的區(qū)域中含有SIX1結(jié)合位點的序列，并構(gòu)建了相應(yīng)的啟動子。利用熒光素酶活性以及染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）試驗，證實了SIX1調(diào)控糖酵解基因的轉(zhuǎn)錄是通過結(jié)合于它們的啟動子來實現(xiàn)的。
由于轉(zhuǎn)錄因子與組蛋白修飾酶之間的相互作用對于基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控至關(guān)重要，且組蛋白乙酰化通常與基因轉(zhuǎn)錄激活密切相關(guān)。為了研究SIX1如何激活糖酵解基因的轉(zhuǎn)錄，研究人員利用免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜方法篩選出了兩個與SIX1相互作用的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶—HBO1與AIB1。利用HBO1和AIB1 KO、KD細胞發(fā)現(xiàn)，SIX1調(diào)控糖酵解基因的表達需通過與HBO1和AIB1的相互作用實現(xiàn)。接下來，研究人員研究了SIX1如何通過HBO1和AIB1調(diào)控糖酵解基因的分子機制。ChIP結(jié)果顯示，SIX1促進糖酵解基因的轉(zhuǎn)錄是通過HBO1介導(dǎo)的H4K5乙酰化和AIB1介導(dǎo)的H3K4乙酰化實現(xiàn)的。
那么，SIX1的上游調(diào)控因子是什么呢？研究人員篩選了靶向SIX1的miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-548a-3p能夠直接且特異地靶向SIX1。miR-548a-3p抑制SIX1表達，并抑制糖酵解基因的表達。利用SIX1 KO細胞檢測發(fā)現(xiàn)，miR-548a-3p通過SIX抑制糖酵解基因的表達。
miR-548a-3p/SIX1軸對腫瘤細胞糖酵解的功能產(chǎn)生什么影響呢？細胞學(xué)實驗證明，miR-548a-3p/SIX1軸調(diào)控了腫瘤細胞的葡萄糖攝取、丙酮酸、乳酸及ATP水平、細胞外酸化率（ECAR）以及細胞有氧呼吸消耗速率（OCR）。SIX1需通過HBO1和AIB1發(fā)揮以上功能。miR-548a-3p/SIX1軸通過調(diào)節(jié)糖酵解影響細胞生長。由于缺氧是實體腫瘤最顯著的特征，研究人員進一步發(fā)現(xiàn)，miR-548a-3p被缺氧抑制，SIX1被缺氧誘導(dǎo)，miR-548a-3p/SIX1軸在缺氧條件下仍發(fā)揮調(diào)節(jié)腫瘤糖酵解和細胞生長作用。
隨后，研究人員利用18FDG標記的小動物PET技術(shù)顯像發(fā)現(xiàn)，miR-548a-3p通過SIX1調(diào)控裸鼠異種移植瘤的糖攝取能力，而SIX1通過HBO1和AIB1調(diào)控糖攝取能力，更重要的是，miR-548a-3p/SIX1軸介導(dǎo)的糖酵解對于腫瘤細胞的生長是關(guān)鍵的。為了驗證生理條件下miR-548a-3p/SIX1軸與糖酵解之間的相關(guān)性，研究人員利用小動物PET技術(shù)對胎鼠進行顯像，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SIX1 KO胎鼠與野生型、雜合子胎鼠相比糖攝取與乳酸水平明顯降低（下圖）。
miR-548a-3p/SIX1軸在臨床上有什么意義呢？首先，研究人員比較了臨床上接受PET-CT檢測的乳腺癌患者腫瘤攝取與miR-548a-3p、SIX1表達的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤攝取高的患者miR-548a-3p表達低、SIX1表達高（下圖）。對更多乳腺癌患者標本進行檢測發(fā)現(xiàn)，miR-548a-3p表達與PGK1、LDHA等糖酵解基因成負相關(guān)、SIX1與糖酵解基因表達成正相關(guān)。TCGA數(shù)據(jù)庫與Oncomine數(shù)據(jù)庫分析也證實了上述相關(guān)性。另外，miR-548a-3p表達高的患者預(yù)后較好。
有意思的是，腫瘤中存在SIX1 Q177R突變，因此研究人員猜想該腫瘤相關(guān)突變體是否與糖酵解基因表達有關(guān)。利用SIX1 KO 腫瘤細胞系與KO MEF，研究人員分別轉(zhuǎn)入野生型、突變體表達載體，檢測結(jié)果顯示，與野生型相比，SIX1 Q177R突變體進一步促進了HK2、GAPDH、PKM2和LDHA基因表達，葡萄糖攝取、丙酮酸、乳酸、ATP水平進一步升高，從而促進了腫瘤生長。
綜上，這項研究闡明了在缺氧條件下，miR-548a-3p表達抑制，其下游靶基因SIX1活化，活化的SIX1通過與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶HBO1和AIB1相互作用，激活了多個糖酵解基因的轉(zhuǎn)錄與表達，進而影響調(diào)控糖酵解的能力，最終促進細胞惡性轉(zhuǎn)化及癌癥發(fā)生（下圖）。
MiR-548a-3p/SIX1軸調(diào)控Warburg效應(yīng)和腫瘤生長
本研究首次發(fā)現(xiàn)了在腫瘤Warburg效應(yīng)中起重要調(diào)控作用的miR-548a-3p/SIX1軸，該軸線將Warburg效應(yīng)與腫瘤緊密聯(lián)系起來，為開發(fā)新的抗癌藥物提供了候選靶標，也為評估惡性腫瘤的預(yù)后提供有用信息。
據(jù)悉，本研究的通訊作者為葉棋濃研究員和徐小潔副研究員，論文的第一作者為李玲博士和梁迎春博士后。該研究得到了中國人民解放軍總醫(yī)院劉陽主任醫(yī)師、李瑛主任醫(yī)師，中科院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所高山研究員， 中國人民解放軍307醫(yī)院王濤副主任醫(yī)師等的大力支持。
參考文獻：
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