惡性腫瘤不僅是一種基因病，也是一種能量代謝性疾病。即使在氧供應充分的條件下，腫瘤細胞也主要以糖酵解獲取能量，稱之有氧糖酵解或“Warburg效應”，這種腫瘤細胞的糖酵解異常會促進葡萄糖攝取和乳酸生成，從而有利于腫瘤的發生發展。目前，“Warburg效應”作為腫瘤的一個典型標志已被廣泛認可。2011年，Robert A.Weinberg教授在Cell雜志發表綜述，將腫瘤異常的代謝表型列入腫瘤十大特征之一【1】（下圖）。近年來，人們幾乎在所有腫瘤中都證實了Warburg效應的存在，靶向“Warburg效應”的腫瘤治療藥物正在火熱開發中。
十余種編碼糖酵解關鍵酶的基因直接負責調控Warburg效應。轉錄因子在調控糖酵解關鍵酶基因以及調控Warburg效應中發揮著直接且關鍵的作用【2】。例如缺氧誘導因子(Hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)、c-Myc、NF-kB、p53等【3】。
HIF-1α是Warburg效應的關鍵調控因子，通過與糖酵解基因啟動子上的缺氧反應元件（hypoxia-responsive elements, HRE）結合來促進糖酵解基因的表達。c-Myc能夠直接轉錄激活編碼葡萄糖轉運體1 (GLUT1)和乳酸脫氫酶 (LDHA) 的糖酵解基因，并促進異常糖酵解。p53腫瘤抑制因子通過直接抑制GLUT1和GLUT4基因的轉錄，從而抑制葡萄搪攝取和乳酸產量【3】。然而，目前報道的調控Warburg效應的轉錄因子只有少數幾個，Warburg效應的轉錄調控機制在很大程度上仍不清楚。
北京時間農歷正月初一凌晨，軍事醫學研究院生物工程研究所葉棋濃課題組在Cancer Cell雜志上以Articles的形式發表了題為“Transcriptional Regulation of the Warburg Effect in Cancer by SIX1”的研究論文，該研究發現SIX1是一個新的調控Warburg效應的關鍵轉錄因子，SIX1調控糖酵解的功能夠直接被miR-548a-3p抑制，首次將miR-548a-3p/SIX1軸與Warburg效應和腫瘤生長聯系起來，并闡明了相關作用機制。
轉錄因子SIX1是器官形成的關鍵調控因子，SIX1敲除的小鼠胚胎存在著多器官發育缺陷、較野生型小鼠個頭小的現象，而且SIX1敲除小鼠在出生后不久就死亡【4】。SIX1在多種腫瘤中高表達，例如乳腺癌、前列腺癌、肝癌、結直腸癌等。SIX1高表達的患者臨床預后較差【5】。SIX1能夠促進腫瘤生長和轉移。然而，SIX1是否調控腫瘤Warburg效應未見報道。
在最新的這項研究中，研究人員利用穩定敲低SIX1的乳腺癌ZR75-1細胞與對照細胞進行轉錄組測序（RNA-seq），結合實時定量PCR技術，發現SIX1能夠影響糖酵解通路。接下來，在SIX1 Knock Out（KO）的乳腺癌、SIX1 Knock Down（KD）的肝癌細胞系中均證實了SIX1能夠促進GLUT1、HK2、PFKL、ALDOA、GAPDH、PGK1、ENO1、PKM2、LDHA 九個糖酵解關鍵基因的轉錄和表達。SIX1基因回補實驗也證實了這一點。在SIX1 KO小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）、KO小鼠胚胎以及胚胎中分離出的肝、腸、肺等組織中觀察得到相似的結果（下圖）。以上均提示，SIX1是一個調控糖酵解基因轉錄與表達的關鍵因子。那么，SIX1是如何調控這些糖酵解基因的轉錄呢？
由于之前報道的ChIP-seq和ChIP-on-chip數據結果提示，SIX1與DNA結合的特征模序為TCAG/TG，數據庫結果也顯示SIX1直接結合于6個糖酵解基因（PFKL, ALDOA, PGK1, ENO1, PKM2和LDHA）的啟動子上。為了研究SIX1如何具體調控糖酵解基因的轉錄，研究人員尋找了受調控的糖酵解基因啟動子上游近3 kb的區域中含有SIX1結合位點的序列，并構建了相應的啟動子。利用熒光素酶活性以及染色質免疫共沉淀（ChIP）試驗，證實了SIX1調控糖酵解基因的轉錄是通過結合于它們的啟動子來實現的。
由于轉錄因子與組蛋白修飾酶之間的相互作用對于基因轉錄調控至關重要，且組蛋白乙酰化通常與基因轉錄激活密切相關。為了研究SIX1如何激活糖酵解基因的轉錄，研究人員利用免疫共沉淀結合質譜方法篩選出了兩個與SIX1相互作用的組蛋白乙酰轉移酶—HBO1與AIB1。利用HBO1和AIB1 KO、KD細胞發現，SIX1調控糖酵解基因的表達需通過與HBO1和AIB1的相互作用實現。接下來，研究人員研究了SIX1如何通過HBO1和AIB1調控糖酵解基因的分子機制。ChIP結果顯示，SIX1促進糖酵解基因的轉錄是通過HBO1介導的H4K5乙酰化和AIB1介導的H3K4乙酰化實現的。
那么，SIX1的上游調控因子是什么呢？研究人員篩選了靶向SIX1的miRNA，結果發現miR-548a-3p能夠直接且特異地靶向SIX1。miR-548a-3p抑制SIX1表達，并抑制糖酵解基因的表達。利用SIX1 KO細胞檢測發現，miR-548a-3p通過SIX抑制糖酵解基因的表達。
miR-548a-3p/SIX1軸對腫瘤細胞糖酵解的功能產生什么影響呢？細胞學實驗證明，miR-548a-3p/SIX1軸調控了腫瘤細胞的葡萄糖攝取、丙酮酸、乳酸及ATP水平、細胞外酸化率（ECAR）以及細胞有氧呼吸消耗速率（OCR）。SIX1需通過HBO1和AIB1發揮以上功能。miR-548a-3p/SIX1軸通過調節糖酵解影響細胞生長。由于缺氧是實體腫瘤最顯著的特征，研究人員進一步發現，miR-548a-3p被缺氧抑制，SIX1被缺氧誘導，miR-548a-3p/SIX1軸在缺氧條件下仍發揮調節腫瘤糖酵解和細胞生長作用。
隨后，研究人員利用18FDG標記的小動物PET技術顯像發現，miR-548a-3p通過SIX1調控裸鼠異種移植瘤的糖攝取能力，而SIX1通過HBO1和AIB1調控糖攝取能力，更重要的是，miR-548a-3p/SIX1軸介導的糖酵解對于腫瘤細胞的生長是關鍵的。為了驗證生理條件下miR-548a-3p/SIX1軸與糖酵解之間的相關性，研究人員利用小動物PET技術對胎鼠進行顯像，結果發現，SIX1 KO胎鼠與野生型、雜合子胎鼠相比糖攝取與乳酸水平明顯降低（下圖）。
miR-548a-3p/SIX1軸在臨床上有什么意義呢？首先，研究人員比較了臨床上接受PET-CT檢測的乳腺癌患者腫瘤攝取與miR-548a-3p、SIX1表達的關系，結果發現，腫瘤攝取高的患者miR-548a-3p表達低、SIX1表達高（下圖）。對更多乳腺癌患者標本進行檢測發現，miR-548a-3p表達與PGK1、LDHA等糖酵解基因成負相關、SIX1與糖酵解基因表達成正相關。TCGA數據庫與Oncomine數據庫分析也證實了上述相關性。另外，miR-548a-3p表達高的患者預后較好。
有意思的是，腫瘤中存在SIX1 Q177R突變，因此研究人員猜想該腫瘤相關突變體是否與糖酵解基因表達有關。利用SIX1 KO 腫瘤細胞系與KO MEF，研究人員分別轉入野生型、突變體表達載體，檢測結果顯示，與野生型相比，SIX1 Q177R突變體進一步促進了HK2、GAPDH、PKM2和LDHA基因表達，葡萄糖攝取、丙酮酸、乳酸、ATP水平進一步升高，從而促進了腫瘤生長。
綜上，這項研究闡明了在缺氧條件下，miR-548a-3p表達抑制，其下游靶基因SIX1活化，活化的SIX1通過與組蛋白乙酰轉移酶HBO1和AIB1相互作用，激活了多個糖酵解基因的轉錄與表達，進而影響調控糖酵解的能力，最終促進細胞惡性轉化及癌癥發生（下圖）。
MiR-548a-3p/SIX1軸調控Warburg效應和腫瘤生長
本研究首次發現了在腫瘤Warburg效應中起重要調控作用的miR-548a-3p/SIX1軸，該軸線將Warburg效應與腫瘤緊密聯系起來，為開發新的抗癌藥物提供了候選靶標，也為評估惡性腫瘤的預后提供有用信息。
據悉，本研究的通訊作者為葉棋濃研究員和徐小潔副研究員，論文的第一作者為李玲博士和梁迎春博士后。該研究得到了中國人民解放軍總醫院劉陽主任醫師、李瑛主任醫師，中科院蘇州生物醫學工程技術研究所高山研究員， 中國人民解放軍307醫院王濤副主任醫師等的大力支持。
參考文獻：
1、Hanahan, D., & Weinberg, R. A. (2011). Hallmarks of cancer: the next generation. cell, 144(5), 646-674.
2、Koppenol, W. H., Bounds, P. L., and Dang, C. V (2011) Otto Warburg’s contributions to current concepts of cancer metabolism. Nat Rev Cancer. 11,325–37
3、Yeung, S. J., Pan, J., & Lee, M. H. (2008). Roles of p53, MYC and HIF-1 in regulating glycolysis—the seventh hallmark of cancer. Cellular and Molecular Life Sciences, 65(24), 3981.
4、Kumar, J. P. (2009). The sine oculis homeobox (SIX) family of transcription factors as regulators of development and disease. Cellular and molecular life sciences, 66(4), 565.
5、Wu, W., Ren, Z., Li, P., Yu, D., Chen, J., Huang, R., & Liu, H. (2015). Six1: A critical transcription factor in tumorigenesis. International journal of cancer, 136(6), 1245-1253.
