胰腺癌（PDAC）的腫瘤發生依賴于KRAS和自噬，但是KRAS在自噬方面的作用仍然未知，這篇研究表明KRAS的抑制和ERK MAPK的藥理抑制增加了自噬通量,而且削弱了糖酵解和線粒體功能。作者設想抑制ERK可以增強PDAC對自噬的依賴，這可能是通過損害KRAS或ERK驅動的代謝過程。他們發現自噬抑制劑和特異性自噬調節因子的遺傳或者藥理學抑制，協同增強了ERK抑制劑介導KRAS驅動的PDAC中抗腫瘤的能力。最終結論：ERK MAPK（或者ERK）和自噬過程的藥物抑制劑組合可能是治療PDAC的有效方法。
KRAS突變是胰腺癌（PDAC）發生發展的關鍵遺傳驅動，并且是維持PDAC腫瘤生長的必要條件。鑒于95%的PDAC都有KRAS驅動突變，美國國家癌癥研究所已經將抗KRAS療法確定為胰腺癌研究的4個優先事項之一。KRAS突變的PDAC的特點是發生多種代謝改變，包括糖酵解、谷氨酰胺降解、自噬依賴性增加?，F在KRAS抗體藥物至少有5個主要的方向。很有前景的方案是針對調節KRAS依賴代謝功能，這些功能支持PDAC發生發展的能量需求。其中一個是自噬和噬菌體調節的過程，即細胞降解細胞器、大分子和細胞廢物循環利用，由此產生的分解產物作為生物能中間體，以維持代謝需求。因為自噬在KRAS突變的PDAC中上調，并且對腫瘤生長很重要，所以自噬抑制劑羥氯喹正在接受臨床評估。羥氯喹作為單藥治療是很有限的，但是和紫杉醇聯合治療很有前景。這篇研究提供了一個新的治療策略：RAF-MEK-ERK級聯抑制劑破壞KRAS驅動的代謝過程，促使PDAC嚴重依賴自噬，從而增強羥基氯喹對自噬的抑制性。
在KRAS突變的人胰腺癌細胞系中，基本自噬水平非常高。為了確定KRA S突變對維持高水平的自噬是否是必須的，作者利用3種技術來研究KRAS急性抑制對自噬通量的影響。作者首先評估了穩定表達串聯熒光報告基因mCherry-EGFP-LC3B的PDAC細胞株的自噬通量。LC3B是自噬相關蛋白，它經過翻譯后修飾，使其脂化并和自噬泡相關聯。利用之前研究驗證過的寡聚siRNA來對KRAS急性抑制，發現6個細胞系的自噬通量增加了2到10倍（圖1a，1b）。RAS抑制劑ARS-1620處理KRAS G12C突變的MIA PaCa細胞后，自噬通量也相應增加（圖1c）。第二，研究者通過體外表達EGFP-LC3b和體外檢測自噬體相關點狀形成來檢測自噬體組裝。結果表明抑制KRAS時觀察到的點狀增加是由于自噬通量增加，而不僅僅是穩態變化所致。第三，研究者通過免疫印跡技術來檢測內源性LC3B-Ⅰ向自噬體相關的脂化LC3B-Ⅱ的轉化。siRNA引起的KRAS抑制增加了LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比率，并且當bafilomycin A1抑制自噬體降解，這增加的比例是不變的（圖1d）。因此，在KRAS突變的PDAC細胞系中，抑制KRAS增加了自噬通量，同時自噬體生成、溶酶體融合和自噬體相關LCB-Ⅱ也提高了。
圖1
作者接下來在Kras驅動的PDAC小鼠模型（iKRAS）中進行研究，通過模型建立的三個腫瘤細胞系中，在用藥物處理后Kras G12D被抑制（24h），自噬通量增加了7-20倍（圖1e），并且LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比例也同樣增加（圖1f）。因此在人、鼠的PDAC中，突變KRAS的抑制導致自噬增加而非降低。
AMPK和Beclin-1是早期自噬形成和噬菌體組裝的關鍵驅動因子。已有研究表明KRAS沉默誘導自噬，研究者接下來測試KRAS變化是否影響上游自噬通路。他們發現shRNA介導KRAS的抑制增加了KRAS突變的PDAC細胞系和iKRAS細胞系中AMPK磷酸化，并且激活或增加了總Beclin-1的水平（圖1g）。另外，將10個KRAS突變PDAC細胞系進行RNA-seq，并對測序數據進行基因集變異分析（GSVA）發現在9個細胞系中短暫的shRNA抑制KRAS和編碼自噬蛋白的基因轉錄增加有關。KRAS突變的PDAC細胞系中觀察到的自噬通量和AMPK活化增加，而在KRAS野生型PDAC細胞系BxPC-3中，抑制KRAS這兩種情況都沒有發生（圖1h，1j）。在兩種不同的胰腺細胞模型中，得出相同結論：KRAS可上調自噬，這是PDAC的關鍵生存機制。
作者發現ERK1/ERK2絲裂原活化蛋白激酶對KARS突變的PDAC的體內、體外生長有重要作用。為了確定這個關鍵KRAS效應通路是否對抑制KRAS誘導的自噬同樣重要，作者用ERK1/ERK2選擇性抑制劑SCH772984（ERKi）處理8個PDAC細胞系（穩定表達mCherry-EGFP-LC3B自噬報告基因）24小時，發現自噬通量增加了3-30倍（圖2a，2b）。ERKi處理的細胞和對照相比，LC3BⅡ/LC3BⅠ比率增加（圖2c），這也證實自噬通量增加。在iKRAS小鼠模型中，作者觀察到ERK抑制同樣使3個小鼠iKRAS PDAC細胞系的Kras G12D沉默，這導致自噬通量大幅度增加10-30倍（圖2d，2e）。
圖2
作者檢測了ERKi處理后AMPK和Beclin-1的活化，發現在抑制KRAS時，抑制ERK也導致人PDAC細胞中AMPK和Beclin-1磷酸化增加（圖2f）。盡管在某些細胞系中PRKAA2和BECN1轉錄增強，但ERKi處理1小時內磷酸化的Beclin-1水平也是增加的，這表明在PDAC中KRAS通過ERK MAPK級聯反應調節自噬。BxPC-3細胞系盡管缺乏KRAS突變，但仍有較高的自噬能力，這是由于ERK信號上調以及ERK依賴下游突變BRAF生長所致。和在調節自噬中ERK信號的關鍵作用一致的是，BxPC-3細胞系經過ERKi處理后同樣表現出自噬通量增加。
作者對ERKi誘導的自噬通量增加的基礎機制進行了研究。首先對12個PDAC細胞系用ERKi或者DMSO處理1小時和24小時，然后進行反相蛋白微陣（RPPA）分析（圖3a）。比較所有蛋白的均值后發現：ERK抑制的有效標記物減少，包括ERK1/ERK2的磷酸化和活化、ERK底物RSK的磷酸化、ERK調節底物MYC總蛋白的減少。ERKi處理24小時后，凋亡介質BIM、PUMA和caspase 7等都被上調。作者進一步驗證了抑制ERK可導致AMPKK的活化，另外還觀察到mTORC1信號的減弱（圖3a，3b）。這兩個信號通路在ERKi刺激下的改變是促進自噬的主要機制。RPPA數據的相關性分析表明磷酸化的AMPK水平和ERK抑制標記物呈負相關，而mTOR通路中成分降低和相同標志物呈正相關。
圖3
作者接下來利用LC-MS/MS對一組經ERKi處理的PDAC細胞系進行極性代謝物水平分析。和RPPA所確定的AMPK活性增加相一致，代謝組學分析也表明ERKi處理的PDAC細胞系中AMP水平有所增加，并且AMP前體IMP和AMP降解產物也有所增加（圖3c）這表明ERKi通過改變核苷酸代謝來增加自噬通量。此外，作者對7株ERK刺激超過24小時的人PDAC細胞系進行了RNA-seq分析，并利用GSVA技術，確定ERKi介導的自噬相關基因和溶酶體基因的表達增加（圖3d，3e）。
RNA-seq分析發現自噬的基因轉錄上調，但誘導ERK抑制的糖酵解基因轉錄本減少（圖3f）。用葡萄糖LC-MS和NMR進行代謝通量分析來驗證這些變化導致糖酵解活性下降。在用[1,6-13C2]孵育細胞之前，作者用siRNA處理細胞，使KRAS基因沉默，發現KRAS抑制和ERK抑制降低了葡萄糖攝取。因此在ERKi處理的7株KRAS突變PDAC細胞中，關鍵糖酵解中間體明顯減少。iKRAS PDAC小鼠模型中的分析表明，突變激活的KRAS驅動糖酵解活性，而Kras G12D的抑制降低了它的活性。作者認為突變激活的KRAS調節了人PDAC細胞ERK抑制后有效抑制的糖酵解活性。作者假設這種ERK抑制誘導的糖酵解活性的降低有助于ERK抑制劑介導的自噬能通量的增加。當去除PDAC細胞的生長培養基中的葡萄糖時，自噬通量增加，但幅度小于ERK抑制。因此，ERK抑制劑治療可直接和間接減少糖酵解來增加自噬通量。
RNA-seq數據顯示ERKi處理導致線粒體相關基因轉錄水平降低（圖3g）。作者之前的研究表明能長期存活的小鼠PDAC細胞系罕見亞型（<10%）更依賴于線粒體呼吸。因此，KRAS沉默或者抑制ERK降低了線粒體相關基因的轉錄，這是出人意料的。作者首先評估了短期KRAS抑制和ERK抑制對線粒體形態和活性的影響，ERKi處理減少了線粒體數量（圖4a）。抑制ERK使有絲分裂通量增加，總PINK1水平增加。因此線粒體成分的轉錄減少，增加的有絲分裂彌補了線粒體數量的減少。作者發現ERK抑制劑處理PDAC細胞，1小時內誘導了線粒體融合（圖4b，4c），這和DRP1(線粒體分裂中間物和ERK底物)的磷酸化水平降低有關（圖4d）。ERKi處理24小時候線粒體融合、DRP1磷酸化水平降低（圖4e，4f）。同時，DEP1總蛋白含量下降（圖4g），這和線粒體相關基因轉錄水平下降是一致的。線粒體在ERK抑制下融合增加，這和人PDAC細胞系中KRAS短期抑制、在iKRAS小鼠模型中Kras G12D抑制的現象一致?？偟膩碚f，ERK抑制和KRAS抑制都會導致線粒體網絡的明顯重排。
圖4
發現在人PDAC細胞系和iKRAS小鼠模型中線粒體融合是和線粒體活性增加有關（圖4i，4j）。在ERKi處理1.5小時后細胞耗氧率并沒有變化（圖4k），而在這個時間段線粒體融合是很強的。因此當人PDAC細胞用ERKi處理24小時，基礎耗氧率和ATP產生出現降低或者不變的現象（圖4l）。在人PDAC細胞抑制KRAS、在iKRAS小鼠模型關閉Kra G12D的表達后都出現相似的現象。在Kras抑制的小鼠模型以及ERKi抑制的PDAC細胞系中備用線粒體含量小幅增加（圖4l），這和線粒體電位增加相一致。由于作者并沒有觀察到耗氧量和ATP的變化，因此這增加的電位并不是用來產生能量。
作者假設在抑制ERK時觀察到的自噬增加可能是PDAC細胞對自噬產生更強的依賴性。若如此，那ERK抑制和自噬同時發生應該比單獨發生更加有效。臨床上沒有特異的自噬抑制劑，因此利用羥氯喹-溶酶體酸化的常用抑制劑-來作為自噬的間接抑制劑。作者發現用SCH772984（ERKi），或MEK抑制劑（MEKi）和羥氯喹同時處理可增強生長抑制（圖5a，5b）。利用Chou-Talalay或者BLISS方法觀察到ERKi或MEKi的協同作用（圖5c）。另外，聯合處理引發的自噬量比ERKi單獨處理增加的多（圖5d）。而且當在人胰腺受試者衍生的器官樣培養物上評估時，ERKi和羥氯喹之間的協同作用是不變的。（圖5e，5f）。
圖5
為了將這些體外發現在腫瘤內驗證，作者在兩個PDX小鼠模型中評估了ERKi和羥氯喹聯合作用。在兩個模型中ERKi單獨處理對腫瘤生長有一定的影響，但聯合處理抑制了腫瘤發生并且生存率有所提高（圖5g）。另外ERKi和羥氯喹同時處理小鼠，腫瘤大小明顯比ERKi單獨處理的小（圖5h）。因此ERK1/ERK2和自噬的聯合抑制對抑制PDAC生長更加有效。
圖6
因為羥氯喹間接抑制自噬體，作者接下來確定自噬的特定組分的遺傳或藥理學阻斷是否也與抑制ERK發生協同作用。作者首先利用shRNA抑制自噬相關基因（ATG5和ATG7），發現在PDAC細胞系中，ATG5或ATG7抑制顯著增強了ERKi引發的細胞生長抑制（圖6a，6d）。現在已開發出更加特異的自噬抑制化合物，包括SBI-0206965（SBI），MRT68921（MRT）和Spautin-1。SBI靶向作用ULK1，MRT靶向作用ULK1和ULK2（AMPK磷酸化的自噬預啟動復合物的組分）。Spautin-1抑制兩種特異性肽酶USP10和USP13，它們調節Vps34復合物中Beclin-1的泛素化，從而啟動自噬體形成。 與羥氯喹一樣，這三種自噬抑制劑都能減少PDAC細胞系的增殖（圖6e）。ATG5和ATG7基因抑制后，和三種藥理抑制劑聯合處理增強了ERK I介導的生長抑制（圖6f，6g）。由于KRAS G12C突變體MIA-PaCa-2細胞對氯喹具有抗性，作者用ARS-1620（RASi）與SBI或MRT組合處理它們，發現ARS-1620誘導的生長抑制的協同增強以及聯合處理的細胞中有顯著增強的細胞凋亡（圖6h，6i）。
作者：楊冰
