腎纖維化幾乎是所有形式的進行性慢性腎臟疾病（CKD）的必然結果，具有較高的發(fā)病率和死亡率，但目前能夠阻止或逆轉腎臟纖維化和CKD進展的治療方法有限。神經(jīng)氨酸酶是一類糖苷水解酶，負責催化唾液酸和糖蛋白之間糖苷鍵的水解。神經(jīng)氨酸酶已被證明在自身免疫疾病、心血管疾病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病以及肺部疾病中發(fā)揮作用，靶向神經(jīng)氨酸酶的特異抑制劑具有治療以上疾病的潛力。然而，神經(jīng)氨酸酶在CKD中的作用尚不清楚。
2023年3月27日，中國藥科大學天然藥物國家重點實驗室齊煉文、張蕾團隊在Nature Communications上發(fā)表題為“Neuraminidase 1 promotes renal fibrosis development in
male mice”的文章，揭示了神經(jīng)氨酸酶1（NEU1）是腎纖維化發(fā)病機制中的關鍵分子，并提出了以NEU1為靶點治療腎臟疾病的潛在途徑。1.慢性腎臟病患者TEC中NEU1升高
作者首先分析人腎臟轉錄數(shù)據(jù)庫Nephroseq中四個神經(jīng)氨酸酶成員(NEU1-NEU4)的表達。在'Ju CKD Tublnt’數(shù)據(jù)庫中，CKD患者NEU1的基因表達顯著上調，NEU1在大多數(shù)CKD類型中升高，包括IgA腎病、糖尿病腎病、狼瘡性腎炎、局灶節(jié)段性腎小球硬化和膜性腎小球腎炎，但在微小病變性腎病中不升高。'Ju CKD Glom’數(shù)據(jù)庫和GSE66494中NEU1在CKD中也是高表達。接下來，作者分析了人的腎臟標本。腎臟纖維化患者表現(xiàn)出嚴重的膠原沉積和腎臟損傷，NEU1蛋白水平顯著增加。此外，NEU1水平與腎小管損傷評分、血清肌酐水平和血尿素氮水平呈正相關。Nephroseq數(shù)據(jù)庫的分析還表明，NEU1的表達與腎小球濾過率呈負相關，并主要在腎臟的腎皮質部分表達。2.NEU1在小鼠纖維化腎中表達上調
接下來，作者在小鼠腎纖維化模型中檢測NEU1的表達。在單側輸尿管梗阻（UUO）以及葉酸刺激建立的腎纖維化模型中，NEU1 mRNA和蛋白表達均顯著增加。NEU1主要定位于小管上皮細胞（TEC）。纖維化腎組織Acta2、Vim、Col1a1、Col3a1和TGFβ的基因表達均顯著升高，NEU1水平與這些纖維化指標呈正相關。3.TEC特異性NEU1缺失抑制小鼠腎纖維化
為了研究NEU1在腎臟纖維化中的作用，作者建立了TEC特異性NEU1敲除小鼠。在UUO模型中， NEU1敲除顯著改善了腎臟形態(tài)，減少了膠原沉積，抑制了小管壞死、小管間質炎癥、巨噬細胞浸潤以及NF-κB磷酸化。另外，NEU1敲除顯著抑制了UUO誘導的KIM1表達。免疫熒光顯示，UUO誘導了部分上皮-間質轉分化（EMT），NEU1敲減可抑制EMT的進展。在葉酸誘導的腎纖維化模型中，NEU1-cKO小鼠也顯示出明顯的腎臟形態(tài)及功能改善。NEU1敲低同樣顯著抑制KIM1表達；HE和Masson染色顯示NEU1-cKO小鼠腎小管損傷和間質纖維化相對較少。另外，敲除NEU1可使巨噬細胞浸潤、EMT標記基因、促炎細胞因子、趨化因子和纖維化因子表達明顯降低。
4.NEU1過表達加劇UUO誘導的小鼠腎纖維化
接下來，作者將AAV9-NEU1原位注射到小鼠腎皮質內，注射5周后，免疫熒光結果表明，腎臟中NEU1的mRNA、蛋白表達和酶活性均顯著升高。NEU1的過表達加劇了UUO誘導的腎臟萎縮、腎小管擴張以及腎臟皮質和髓質的膠原沉積。UUO刺激的巨噬細胞浸潤、趨化因子、促炎細胞因子、干擾素、黏附分子和纖維化因子的表達也因NEU1過表達而加劇。5.NEU1與TGF-β受體Alk5相互作用
作者接下來探索NEU1促進腎纖維化的潛在機制。作者首先對PCR芯片的差異表達基因進行KEGG分析發(fā)現(xiàn)富集的前三個通路分別是AGE-RAGE，轉化生長因子β（TGF-β），癌癥相關蛋白多糖途徑。由于TGFβ是導致腎小管上皮細胞間質轉化和纖維化的主要因子，作者重點關注了TGF-β通路。接下來作者探索NEU1是否通過TGF-β受體促進腎纖維化，首先通過Co-IP在人腎和HK2細胞中驗證了NEU1與多個TGF-β受體（ALK1-7以及AMHR2,ACVR2B,TGFBR2）直接作用，其中Alk5有較強的親和力。表面等離子共振結果表明NEU1與Alk5的162-403位氨基酸具有良好的結合親和力，但重組蛋白不能結合1-125或200-503區(qū)域。因此，作者預測Alk5的160-200氨基酸區(qū)域是NEU1結合區(qū)域。作者構建了一個包含ALK5 160-200氨基酸序列的Flag-tag質粒，確認了NEU1與Alk5的這個結構域相互作用。
6.NEU1與ALK5相互作用增強ALK5/SMAD2/3信號通路
NEU1與ALK5互作如何促進腎纖維化？在HK-2細胞和小鼠腎臟中，NEU1沉默顯著抑制了Alk5-Smad2/3通路。作者進一步驗證NEU1是否以ALK5依賴的方式促進腎臟纖維化，發(fā)現(xiàn)敲減Alk5后，NEU1過表達不能激活ALK5-Smad2/3信號通路。為了探索NEU1在細胞中是否作為一種糖苷水解酶起作用，作者利用生物標記的接骨木凝集素(SNL)與唾液酸特異性結合在腎纖維化模型中驗證了NEU1通過去除唾液酸發(fā)揮作用。
7. 丹酚酸B靶向NEU1減輕UUO誘導的腎纖維化
作者進一步尋找靶向NEU1減輕纖維化的化合物。作者使用SPR篩選了74種藥用植物天然產(chǎn)物與人重組NEU1蛋白的結合能力，發(fā)現(xiàn)丹參的有效成分丹酚酸B與NEU1蛋白有很強的結合親和力。Co-IP和PLA實驗表明丹酚酸B顯著抑制NEU1和Alk5之間的相互作用。在腎小管上皮細胞中TGFβ誘導的Alk5磷酸化、Smad2/3信號通路的激活也被丹酚酸B阻斷。在體內，HE和Masson染色結果表明丹酚酸B顯著減輕UUO誘導的腎損傷和腎纖維化、促炎細胞因子的產(chǎn)生和膠原沉積。 作者采用NEU1 CKO小鼠模型探究NEU1是否介導丹酚酸B的保護作用。在Neu1 CKO小鼠中，丹酚酸B不能減輕腎損傷和腎纖維化，所以NEU1是丹酚酸B腎保護所必需的。
總結： NEU1在CKD患者和小鼠腎纖維化模型的腎臟中顯著上調。在功能上，腎小管上皮細胞特異性的NEU1基因敲除可抑制上皮-間充質轉化、炎性細胞因子的產(chǎn)生和膠原沉積；NEU1的過表達會加劇進行性腎臟纖維化。在機制上，NEU1與TGFβ受體Alk5的第160-200氨基酸區(qū)域相互作用，穩(wěn)定Alk5，促進Smad2/3活性。丹參有效成分丹酚酸B能與NEU1強結合，并以NEU1依賴的方式有效地減輕小鼠腎纖維化。總而言之，這項研究闡述了NEU1在腎臟纖維化進展中的促進作用，并提出了以NEU1為靶點治療腎臟疾病的潛在途徑。
撰文：杜彩霞
審校：李曉晨
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