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在20世紀下半葉，IgE依賴性過敏性疾病(也稱為“特應性疾病”，包括哮喘、過敏性鼻炎、特應性皮炎/濕疹和食物過敏)的顯著增加已成為令人費解的謎團。自20世紀80年代以來，流行病學家和免疫學家一直在著力解決這種由過敏性疾病意想不到的增加所帶來的一系列問題。所有的研究表明，在第二次世界大戰以后，發達國家的生活方式和環境的改變對這種增加要負很大的責任。并不是所有問題都已有答案。然而，現今的許多研究為我們提供了一個概念和操作框架，以便更好地了解人類歷史上的這一獨特現象。巧合的是，人們重新對微生態產生了興趣，數十億計的微生物構成了微生物群落，并且在哺乳動物腸道中發揮著共生功能。這些微生物被認為是人體動態平衡中的重要參與者；其基因組(微生物組)以不同的方式與宿主的基因組相互作用。在促進免疫耐受性方面，環境影響與腸道微生態之間的關聯已經被建立，再加上微生物工程的進展，使我們更加期待過敏性疾病的治療和(或)預防的璀璨未來。盡管現今看來，在許多擁有西化生活方式的國家，過敏性疾病的流行已經到達平穩期，但是考慮到新興市場經濟的國家和城市規模不斷擴大的資源短缺國家，它仍是全球公共衛生問題。

在總結了我們目前了解的過敏性疾病與微生態之間的聯系后，本文將重點關注20世紀90年代出現的一個令人特別困惑的問題：農業環境對過敏性疾病的保護作用。隨著生活方式的改變，過去存在的有利的兒童適當免疫系統發育發生不可逆性損害，微生物工程能否并怎樣修復這種微生物與免疫系統的相互作用仍舊是一個問題。大多數研究結果來自歐洲的橫斷面研究，主要包括關于過敏和內毒素(ALEX)的研究；與農業和人類生活方式相關的兒童過敏風險因素預防(PARSIFAL)的研究；歐洲共同體關于哮喘的遺傳與環境因素的多學科研究；以及我們參與了13年的歐洲五國病例專門用來闡明農業與過敏關系的過敏防護的研究——農村環境研究(PASTURE)。我們在世界各地進行的其他研究和常規益生菌預防過敏的綜合評價中發現了補充數據。雖然過去幾年我們已經知道上呼吸道、皮膚和肺的微生物群以及長期被認為是無菌的母乳的微生物群參與了過敏性疾病的發生和(或)表現，但還不太清楚它們之間的因果關系；因此，在本文將不會探討這些關系，我們將重點關注腸道微生物組。

（一）遺傳因素

1923年Coca和Cooke首次提出將包括哮喘、過敏性鼻炎、特應性皮炎、蕁麻疹和食物過敏在內的一系列家族性/遺傳性疾病命名為“特應性疾病”。現在被人們廣泛接受的描述是：特應性疾病是一種結合了遺傳和環境因素的多因素相關疾病。常見的遺傳因素引起針對環境抗原IgE抗體過度或不適當應答相關的疾病，并導致各種臨床表現。

患有過敏性疾病的兒童中，在考慮到祖父母的情況下，50%有過敏家族史；在同卵雙胞胎中有相同類型的臨床表現的傾向，這也為特應性疾病的遺傳性質提供了證據。最近的全基因組關聯研究已經發現了幾種可能引發哮喘的新基因，包括IL18R1、IL33、SMAD3、ORMDL3(對應于染色體17q21，尤其是兒童期發病疾病)、HLA-DQ和IL2RB基因位點的單核苷酸的多態性。因為這些基因的流行病學的差異，大多數哮喘/特應性疾病基因不能跨越群體復制，這種現象也可在中國受試者和其他種族的受試者之間觀察到。在某種程度上，不同中國人群中的17q21染色體上ORMDL3基因多態性研究結果并不一致。盡管最近的研究表明，事實上這些基因多態性與中國東北地區漢族兒童哮喘的發病有關，正如與白種人兒童中發現的一樣。

已經發現控制IgE水平的基因與介導哮喘易感性的基因幾乎沒有重疊；前者更直接地涉及“特應性”背景。特應性或IgE依賴性免疫譜以2型T輔助細胞(Th2)免疫優勢應答為免疫學特征，包括白細胞介素(IL)-4、IL-5和IL-13的分泌，也可在蠕蟲感染和胎兒期觀察到，這與由促炎細胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α和干擾素-γ(IFN)的分泌支配的適于抵抗細菌和細胞內感染的1型T輔助細胞(Th1)譜相反。然而，23%的沒有任何家族史的兒童也會出現哮喘和(或)過敏，并且在那些過敏性疾病一直呈上升趨勢的國家，這個比例可能會隨時間的推移不斷變大。

（二）個人史和環境因素

現在已經確定，環境因素在過敏性疾病致敏的發展和疾病的臨床表現中起主要作用。母親吸煙是公認的家庭/環境風險因素，并且已經證實子宮內或生命早期的二手煙暴露可與最近確定的哮喘潛在基因相互作用。西歐/北歐和美國的過敏性疾病發病率的增加以及與“發展中國家”觀察到的差異最初歸因于更好的診斷，以及與過去沒有或很少遇到的過敏原物質有關。

然而，很快出現的是，過敏性疾病的發病率在醫療水平相似的“發達”區域/國家之間，在城市與農村環境之間和(或)在富裕區域與較不富裕區域/國家之間也可能顯著不同。18世紀的英國家庭醫生已經做了類似的觀察，他們強調，農民的孩子盡管經常與干草接觸，但與那些城里的孩子相比，他們極少出現季節性過敏性鼻炎。比較中國(如香港、廣州和北京；或香港、北京和烏魯木齊)不同發展水平地區的過敏性疾病的流行程度，以及第一代和第二代移民人群的過敏性疾病發生率，從發展中國家到發達國家，在不同人群的遺傳學背景的條件下，完全支持生活方式對過敏性疾病發生率的改變作用。20世紀80年代和90年代全球流行病學研究排除了空氣污染對過敏性疾病發病率增加的責任，并明確了其在呼吸道疾病臨床癥狀嚴重程度方面的重要作用。在出生后第一年的母乳喂養和(或)食物多樣化方面的研究提供了不只是一些非結論性的結果，這些結果總結在綜述和Meta分析中。

在20世紀80年代和90年代進行的橫斷面研究強調了一系列環境狀況，這些狀況可以解釋過敏性疾病的“后工業革命流行” 現象。例如，大量兄弟姐妹的“保護效應”是Strachan在1989年提出的流行的“衛生假說”的起源，其他國家的類似研究以及早期日托護理和兒童常見病毒感染(如甲型肝炎、麻疹或弓形蟲感染)的保護作用進一步證實了這一假說。

從那時起，過敏性疾病的免疫模式不斷被重新審視，并已從“衛生”和“缺乏感染原的免疫刺激”轉移到非致病性微生物接觸的免疫調節 (圖1)，如過敏性疾病發生風險與剖腹產及母嬰進行抗生素治療之間的聯系。雖然寄生蟲感染與一些過敏性疾病有相似的TH2免疫機制，但是它有意想不到的保護作用，如圖１所示，它通過建立和維持免疫耐受而不單是通過TH1細胞反應來抵抗微生物。

（一）流行病學調查

大多數關于農業環境的歐洲研究始于20世紀90年代初的觀察。生活在德國東部地區的兒童的過敏性疾病患病率比生活在西部的兒童低(兩地區特應性過敏性疾病發病率分別為18.2%和36.7%；兩地區哮喘和過敏性鼻炎發病率分別為3.9%和5.9%)，這種差異在德國統一后便消除了。俄羅斯與芬蘭Karelia相比，以及愛沙尼亞和波蘭與瑞典相比，兒童特應性疾病的患病率較低。

研究者認為，室內燃木爐具和燃煤爐具的使用與過敏性疾病的減少有關。基于德國巴伐利亞南部農村社區供暖方式所帶來的影響的補充研究，一個位于德國慕尼黑的研究團隊認為，室內燃木爐具和燃煤爐具或可成為更傳統的生活方式及農民父母務農的替代品。農村和非農村家庭的生活方式的比較充分證實了這個建議的可行性。根據這些結果，以及20世紀90年代末在奧地利、瑞士、芬蘭和加拿大開展的研究結果，顯然在較少開發的農村環境下，保護性因素會起作用。ALEX研究的結果證實，當傳統農業和生活方式得到保護時，這種保護因素才會更加明顯。最近的研究以及專門的PARSIFAL和GABRIEL橫斷面研究和PASTURE隊列研究，都證實了農業環境的獨特作用。關于農業環境與過敏性疾病之間關系的研究，直到2010年在von Mutius和Vercelli的綜述中才出現。農民和非農民之間的生活方式可能存在差異，如孕產婦吸煙史、母乳喂養的持續時間和其他飲食習慣、日托、是否養寵物、家庭規模、家長受教育水平和家族過敏史，在所有混雜因素都排除后進行統計分析，發現這種差異不足以解釋這種保護性“農業效應”。

通過對比各種研究，一致認為兒童過敏發生的獨立保護因素包括：①留在谷倉和馬廄，以及動物暴露；②飲用未經殺菌的牛奶。母親懷孕期間暴露或兒童生活早期暴露都有可能起到保護作用(圖1)。

圖1 可能增加或降低兒童過敏性疾病的發生風險的微生態相關因素。免疫平衡的原理被自動簡化。T細胞調節機制包括：通過先天性免疫，特別是通過Toll樣受體(TLR)、樹突細胞和相關細胞因子(IL-12、TNF-α等)的干預來塑造適應性免疫；Th2細胞和細胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)的抑制；以及誘導不同調節性T細胞群和調節細胞因子[IL-10、腫瘤生長因子(TGF)-β等]

（二）谷倉/牛棚環境及動物暴露的作用

在以乳制品生產為主且農業沒有工業化的歐洲地區，即在阿爾卑斯山和Jura山山腰奶酪生產區，人們已經開展了廣泛的研究，旨在解釋這種來自于農業的預防過敏的因素，如ALEX、GABRIEL高級調查和PAS-TURE。研究者仔細記錄農業活動各方面以及農場及其環境的特征，并在馬廄、谷倉和家中包括室內灰塵以及母親和嬰兒/兒童床上的床墊灰塵中收集特定的環境樣品(內毒素、過敏原、革蘭陽性菌和革蘭陰性菌、霉菌和真菌)。人們還進行了特定的嵌套研究，以根據農場的建筑和地理特征以及農業活動更好地識別農場的微生物環境，并且確定農場牛奶的微生物和化學組成。

與農業生活方式相關的暴露包括在谷倉和(或)馬廄中的逗留時間，以及與農場動物(主要是牛、豬和家禽)接觸的時間(偶爾會接觸貓和狗)。ALEX研究中，1歲以下兒童暴露于馬廄，與1~5歲兒童相比，哮喘發生率(1%對11%)、過敏性鼻炎發生率(3%對13%)和特應性致敏發生率(12%對29%)較低；這種對哮喘的保護作用獨立于特應性致敏的保護作用。在同一研究中，狗接觸與哮喘和過敏性疾病之間的反比關系可通過同時暴露于特定動物來解釋或僅限于農場的兒童。母親在懷孕期間暴露于谷倉和馬廄和(或)農場動物也被證明有至關重要的作用。在德國的另一項研究中，與擁有兼職農業活動的家庭相比，家庭全職經營一個農場的兒童的患病風險下降更明顯。在GABRIEL高級調查第二階段8419名兒童的分層隨機抽樣樣本中，與非農場兒童相比，生活在農場里的兒童患哮喘、過敏性鼻炎、特應性皮炎和特應性致敏的風險顯著降低；整體的“農場效應”可通過特定暴露于奶牛和接觸秸稈的哮喘，及暴露于飼料儲存室和糞便的特應性皮炎來解釋。

妊娠期到1歲是嬰兒各類過敏性疾病的患病窗口期，然而,在5歲之前連續長期暴露于畜舍環境當中的兒童的哮喘、過敏性鼻炎、特應性致敏的患病率最低。另外也有研究表明長期微生物暴露也可能對人體健康有益，一個對超過2500個家庭進行的橫斷面研究顯示，與僅在兒童時期的微生物暴露或者成年后的微生物暴露相比，在兒童和成年時期都接受微生物暴露的組合與氣短、哮鳴、哮喘以及哮喘藥物的使用存在很強的負相關。而且上述癥狀發生的概率與兒童和成年時期接受微生物暴露的時間呈負相關。美國最近的一項研究也表明，在成年人中仍然可以觀察到母親和嬰幼兒早期微生物暴露對其健康的影響。

PASTURE及其相關的研究結果提出了全新的觀點，即母親妊娠期間暴露于農場環境后會影響其過敏狀態及其后代過敏性疾病的遺傳易感性，這與調節性T細胞(Treg細胞)的免疫狀態受損有關。有研究發現新生兒臍帶血中IgE抗體水平和季節性過敏原水平與母親妊娠期暴露于農場環境呈負相關，而臍帶血中Th1細胞因子(過敏的保護性免疫因子)水平與母親接觸各種動物有直接關系。母親妊娠期暴露于農場環境可以上調新生兒臍帶血中Treg細胞的數量及功能，這與淋巴細胞增殖及下調Th2細胞因子分泌有關。母親暴露于農場環境與新生兒臍帶血中的Th17細胞相關轉錄因子表達水平和FOXP3 mRNA(Treg細胞亞群的標記)表達水平之間呈正相關。從4.5歲到6歲，Treg細胞數量、FOXP3 mRNA以及Th1/Th2/Th17相關標志物的mRNA表達水平降低，這可能與暴露于農場環境的頻率降低、環境中微生物的內毒素(LPS)刺激減少有關。

研究發現兒童時期暴露于環境當中的內毒素水平在過敏性疾病的發生發展過程中起到重要保護作用。在ALEX研究中發現，與居住在非農場環境的家庭相比，居住于農場的家庭的廚房地板及兒童床墊粉塵中的內毒素濃度更高，其中畜舍中內毒素濃度最高。經常接觸農場動物的兒童家庭中床墊和廚房地板粉塵中的內毒素水平也顯著升高。而其他研究結果表明，暴露于包括各種細菌、放線菌、霉菌及其他真菌在內的環境微生物的多樣性，比暴露于單一的細菌組分或農場微生物數量的多少更重要。

有研究指出接觸干草、麥稈、飼料及青貯飼料也是過敏性疾病的保護性因素。PARSIFAL研究結果表明，兒童幫助父母割干草作為與農場環境相關的唯一變量，與其當前的臨床癥狀和醫生診斷其為特應性皮炎的診斷呈負相關。PARSIFAL項目當中的一項巢式研究表明，冬季谷倉和畜舍內的花粉水平明顯高于夏季，并且遠遠超過了花粉季節室外的花粉水平，因此表明兒童在免疫系統發育成熟的過程中吸入大量的花粉有助于建立免疫耐受。真菌、放線菌以及青貯飼料當中的細菌是微生物暴露的重要組成部分，它們共同參與了“農場效應”。微生物從谷倉、畜舍等傳播到住宅，從而增加了微生物的暴露水平。

兒童暴露于農場環境的保護效應不只限于奶牛養殖場或歐洲農場；一些研究還顯示，兒童在1歲之前生活在作物種植家庭與哮喘保護作用之間呈正相關。在中國廣東進行的一項研究顯示，室內粉塵中的內毒素水平與預防哮喘相關。然而，目前支持“農場效應”的生物及非生物保護因素的相關證據仍較少。

（三）攝入生牛奶與過敏性疾病的關系

歐洲大陸、英國、希臘克里特島和新西蘭的流行病學研究表明，在母親妊娠期間及嬰幼兒1歲之前攝入生牛奶對過敏性疾病具有保護效應。ALEX研究表明，母親妊娠期間及嬰幼兒1歲之前攝入生牛奶可以降低哮喘(0.8%vs.11.8%)、過敏性鼻炎(0.8%vs.16.0%)和特應性致敏(8.2%vs.32.9%)的患病率。攝入生牛奶對過敏的保護效應是獨立的且與暴露于谷倉、畜舍或農場動物等因素具有協同效應，并且在調整了潛在的混雜因素后仍然具有顯著的保護效應。PARSIFAL和GABRIEL研究對環境和飲食對機體的影響進行了詳細分析，結果表明，攝入生牛奶對過敏性疾病具有特異且獨立的保護效應。在以前的研究中已經發現攝入生牛奶的保護效應與家族過敏史無關，而且對非農場環境成長的兒童仍然有效。在PASTURE研究當中，臍帶血中Th1細胞因子水平升高也與母親妊娠期間的生牛奶攝入獨立相關，而且與生牛奶攝入量之間具有累加效應。研究發現臍帶血中的Treg數量也與母親在妊娠期間生牛奶攝入相關；母親妊娠期間攝入生牛奶的后代當中FOXP3去甲基化水平增加，提示機體通過表觀遺傳學修飾調節了Treg細胞介導的免疫耐受。除此之外，兒童在4.5歲之前生牛奶的攝入與Treg細胞數量的增加和FOXP3去甲基化水平的升高獨立相關。臨床研究顯示，與攝入巴氏滅菌牛奶相比，兒童在6歲以前攝入生牛奶可以降低哮喘風險。

如上所述，來自革蘭陰性菌的內毒素是保護過敏性疾病的首選；而在PASTURE研究中從農業家庭收集的牛奶的內毒素水平并不高于非農業家庭。近期的研究表明，來自霉菌和革蘭陽性菌的β-(1→3)-葡聚糖、胞外多糖和胞壁酸可以降低農村和城市人群過敏和哮喘的發病風險。實驗研究還證實，畜舍當中粉塵提取物的抗過敏生物活性不單是由內毒素介導的。一般而言，微生物暴露的多樣性，包括真菌和細菌，與降低農場兒童過敏風險相關。這里的生物多樣性主要是指生牛奶和生牛奶相關產品中存在的微生物的多樣性。包括犁頭霉屬(Absidia spp.)、歐洲蠊屬(Eurotium spp.)、枝孢屬(Cladosporium spp.)、青霉屬(Penicilliun spp.)在內的多種真菌以及嗜溫放線菌，不僅可能從畜舍和谷倉轉移到住宅，而且還可能存在于牛奶之中。雖然GABRIEL研究在生牛奶中發現了多種微生物，但是嗜冷菌、農場牛奶中的總活菌數或細菌亞群與哮喘沒有顯著相關。該研究表明，非活菌組分可能參與免疫調節效應，非細菌微生物及非微生物組分也可能參與其中。巴氏滅菌牛奶和生牛奶當中存在不同的非微生物組分，非微生物組分可以作為天然的“益生元”在過敏性疾病的發展過程中調節免疫應答，這些非微生物組分是目前的研究熱點。

在PASTURE研究中觀察到6歲兒童攝入的生牛奶中含有更高水平的ω-3多不飽和脂肪酸，可能是降低其患哮喘的風險的部分原因。而通過給予小鼠富含共軛亞油酸的飼料后，盡管共軛亞油酸水平在血漿和紅細胞膜中升高，但是這種飲食既沒有改善卵清蛋白致敏小鼠的過敏性氣道炎癥，也沒有影響到小鼠支氣管肺泡灌洗液中的類花生酸通路水平。另外，血清當中乳清蛋白、牛血清白蛋白、α-乳清蛋白和β-乳球蛋白增加的水平與哮喘呈負相關，但與遺傳性過敏性疾病無相關性。另外維生素D也可能參與其中，PASTURE研究表明，在妊娠期間母體補充維生素D增加了與誘導免疫耐受相關的ILT3和ILT4的表達水平。目前生牛奶奶酪是否具有類似效應尚未得到驗證。然而，生牛奶奶酪中的微生物菌群的多樣性以及奶酪加工過程中微生物組分含量的變化可能是生牛奶奶酪可以在維持良好的免疫平衡方面發揮作用的原因。無論生牛奶中的何種成分可能與其保護作用有關，它們的作用機制都尚待進一步研究。

（一）腸道菌群誘導免疫耐受

早在20世紀70年代，隨著無菌小鼠和悉生小鼠動物模型的發展，免疫學家通過對無菌動物進行糞菌移植實現腸道黏膜免疫重建的研究，發現腸道菌群在誘導腸道相關淋巴組織的免疫應答以及調節對微生物和外源性蛋白質的免疫反應中發揮了重要作用。在經歷了近30年的瓶頸期后，由于21世紀基因組技術在微生態研究領域的迅猛發展，微生物組作為機體“宏基因組”的重要作用被研究人員揭示。研究發現腸道菌群不但參與了免疫反應，而且通過調節代謝和機體相互作用來建立和維持機體自穩態。隨著基于16S rRNA高通量測序技術的高速發展，研究人員規避了需要用傳統微生物培養方法來研究微生物的局限性及偏差。人腸道中至少存在100萬億個微生物，主要包括了擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和疣微菌門(Verrucomicrobia)等五個門的細菌，腸道微生態與機體存在共生關系和協同進化關系，可以促進宿主免疫系統的發育及調節機體免疫系統平衡。近年來越來越多的研究表明腸道微生態與健康和疾病之間有密切的關系。

在免疫系統的發育過程中，微生物群的參與早已為人所知，并且長期以來人們一直猜疑它是否在免疫耐受方面起作用。微生物信號對腸道孤立淋巴濾泡的發生和發展，以及對通過上皮細胞成熟和血管再生建立腸道屏障起著決定性的作用；這些過程包含多種模式識別受體(PRRS)，這些受體能夠檢測微生物相關分子模式(MAMPS)，包括Toll樣受體、NOD樣受體和RIG樣受體。控制機體與病原體首次接觸的因素也包括黏膜層與抗菌肽，這兩者都由微生態嚴格調控著；微生物群來源產物與PRRS的結合引起多種抗微生物多肽的表達，這些多肽能夠防止細菌通過宿主組織空隙遷移。這些多肽包括RegIIIγ lectin，它在無菌小鼠出生或者在微生物定植后表達，并且對革蘭陽性菌有殺菌作用。以及α-防御素和隱窩素，它們由潘氏細胞在PRR NOD2的調控下產生。

微生物群可以調控宿主對攝入微生物/抗原的耐受性，這個方法和微生物群通過腸道固有下層間隔來源的樹突細胞調控腔內容物抗原樣本有關。最近的報告顯示，腸道微生態可以直接促進固有層常駐CX3CR1巨噬細胞的浸潤，其與局部Treg細胞的浸潤有關；然而，微生態對M細胞的影響還需要進一步的研究，該細胞對抗原轉移和黏膜抗原呈遞細胞功能特異。微生態對分泌型IgA(sIgA)的發育和抗原表位識別也是至關重要的，sIgA是由腸道相關淋巴樣組織(GALT)中B細胞產生的免疫球蛋白的主要類型，在腸內腔分泌并穿過黏膜上皮。sIgA涉及在黏膜層捕獲細菌和機體非必需氨基酸，這樣就能防止變應原的系統性吸收和特應性致敏。sIgA在其與腸道上皮細胞基底膜上的多聚免疫球蛋白受體(PIgR)結合之前，還可以通過阻止變應原接近結合在黏膜肥大細胞上的特異性IgE，從而預防食物過敏。

腸道黏膜是哺乳動物與環境微生物、威脅生命的非生物組分接觸的第一道防線。為了防止對其他無害外來成分(如膳食和其他環境蛋白質)產生有害反應，微生態通過嚴格調節細胞因子的合成來控制由T細胞調控的炎癥和調節應答之間的微妙平衡。無菌小鼠體內微生物群缺如、基礎細胞因子廣泛缺失，使得CD4⁺T細胞群的分化簇減少，這將不成比例地影響Th1和Th17細胞。無菌小鼠腸道復雜微生物群的定植使得Th1、Th17和Treg細胞恢復廣譜的應答。口腔耐受的存在已經被人所知數十年了；然而，得益于對Treg細胞和細胞因子更好地理解，它的機制和對腸道微生物的依賴最近才被部分闡釋。事實上，耐受誘導是腸道的默認免疫途徑。耐受誘導的類型與飼喂的抗原劑量有關——無反應性/缺失抗原對應高劑量，Treg細胞誘導對應低劑量。用細菌LPS飼喂無菌小鼠可以有效地恢復口腔耐受的進程；此外，微生物群的存在與抗原喂養后IgE和Th2應答的抑制相關。

然而，口服耐受現象中內毒素及其與TLR4的相互作用，以及微生物來源信號靶點的精確分子機制，仍然沒有被完全理解。內毒素實驗中一些無法解釋的差異和早期兒童過敏發展中內毒素產生的不明確作用是相一致的。腸道上皮細胞和腸道微生物對腸道樹突狀細胞的調節誘導產生CD103⁺維甲酸依賴樹突狀細胞，反過來該細胞誘導Treg細胞及其在黏膜表面的各種細胞因子的分泌。在口服耐受中發現Th3型Treg細胞是腫瘤壞死因子(TNF)-β依賴性的，并在其表面表達LAP。1型Treg細胞(Tr1)由鼻部抗原誘導，并且是IL-10依賴性的；此外，FOXP3⁺-誘導的Treg通過口服抗原和口服芳基烴受體配體誘導。維甲酸現在似乎是Treg系統的主要調節劑。然而，控制維甲酸代謝涉及的酶的活化以及微生物群或者病原微生物修飾維甲酸代謝的過程的精確因素還很難理解。通過TLR2與微生物產物相互作用可以促進維甲酸的代謝；維甲酸缺失導致微生物群顯著的改變進一步支持了微生物群和維甲酸代謝之間存在相互調節作用這一假設。

（二）腸道微生態和過敏的發生/預防

得益于腸道微生態的免疫學作用，過敏性/特應性疾病相關的免疫反應類型，以及先天性免疫(尤其是TLR)、Treg細胞和細胞因子相關的調節機制參與預防特應性致敏和反應，強調產前和產后環境影響可能由腸道微生態改變來調節。存在于其他部位(針對過敏性疾病臨床表現)的微生態，比如上呼吸道、肺或者皮膚微生態，也可以發揮很重要的作用。如上所述，進行流行病學研究需非常謹慎以排除偏移和混雜因素，但仍有幾個研究強調了在農場環境和(或)乳業養殖生活方式中存在著幾種保護性因素的疊加或者協同效應，這包括了針對農場動物、原奶和(或)原奶產品的農場特應性暴露與下述因素的結合，如分娩方式、同胞數、母親和兒童感染史、抗生素治療、暴露于寵物或者室內變應原(包括住處的塵螨和谷倉中的花粉)以及食物成分[比如母乳喂養、早期食物多樣化和發酵食品的定期攝入(圖1)]。

很明顯，這些因素無論單獨還是一起都可能會影響腸道微生態的構成。在自然分娩中，產道是嬰兒與微生物群第一次接觸的部位，這些微生物群將定植于新生兒腸道以確保其具有免疫功能。由于抗生物可能會顯著減少任何部位的總微生物群，并且可能會持久地改變腸道微生物群組成的比例，在母親懷孕期間和新生兒時期，特別是住院早產兒，使用抗生素治療會改變腸道微生態并以某種方式阻止免疫耐受的建立。微生態的組成從新生兒到成年發生了顯著的改變，并且變得依賴于吸入或者攝入的環境微生物組分以及非微生物飲食組分，這些可能影響微生物群基因的類別。在PASTURE研究中觀察到，除了原奶攝入的影響外，在出生后第一年補充多樣性輔食可以降低其后發生特應性皮炎的風險，而且出生后第一年攝入牛奶也可以降低特應性皮炎的風險。遺憾的是，這些兒童的腸道菌群組成沒有報道。

在高通量DNA測序技術出現之前，使用糞便培養和(或)特定微生物代謝組的研究顯示，過敏性疾病患病率不同的國家的兒童的腸道微生物群存在差異。并且差異也存在于發生過敏的兒童、沒有發生過敏的兒童和兩種情況都有的兒童之間。造成差異的原因有：兒童不同的飲食，尤其是很多傳統食物(包括原奶和發酵乳、奶酪和其他發酵食品)的攝入；暴露于內毒素；在大家庭中生活；非過敏兒童更少地使用抗生素；和(或)在低風險國家的兒童和(或)其母親很少使用抗生素。這些研究強調了微生態組成多樣性的重要性，并且該重要性會隨著時間改變。一項研究將1周齡、1月齡和12個月齡的IgE相關過敏兒童或者直到2歲都沒有過敏臨床表現的兒童的糞便樣品進行16S rDNA焦磷酸測序，也證實了上述結果。在哮喘兒童中也進行了相似的觀察研究；然而，在有無過敏兒童之間，細菌門和屬的相對豐度沒有顯著差異。同一團隊的另一研究發現，嬰兒期腸道微生態多樣性的減少和特應性致敏、過敏性鼻炎和外周血嗜酸性粒細胞增多的風險增加有關，但在兒童6歲前，與哮喘或特應性皮炎無相關性。在一項國際性合作研究中，在斯坦納學校(以人智學的理念為基礎運作)的兒童糞便中的微生物多樣性顯著高于農場兒童，而農場兒童的多樣性高于對照組。在樣品組中發現乳酸菌(LAB)亞群存在著巨大的差異；在一些兒童中，LAB亞群以尚未被培養出的物種為主。暴露的多樣性，而不是攝入或者吸入的總微生物量，對適當塑造微生物群來說是必要的，在這方面，農業環境暴露代表了生物多樣性形成的一個模式。

（三）理解微生態與過敏免疫決定因素之間交互作用的免疫機制

盡管有很多關聯農場環境和微生態的理論依據，以及來自設計嚴謹的流行病學調查和免疫學研究的可信成果，但是很顯然，在各種研究中使用不同的技術方法和研究設計，是目前阻止我們發現“好的”微生物群以保護嬰兒或者兒童、預防過敏性疾病的進一步進展的原因。此外，過敏性傾向與微生態之間更多地是交互聯系作用，而不是可以證明的因果關系，關于介導暴露事件順序的分子機制、微生物群的組成改變及其免疫結果，我們所知甚少。

第一組證據來自經常觀察到的TLR的定性或定量變化和通過農業環境暴露保護兒童先天性免疫相關受體，以及微生態與先天性免疫之間的密切聯系。

ALEX研究首先指出了農場環境與先天性免疫受體(特別是TLR2、TLR4和CD14)的定量(表達水平)和定性(多態性)之間的關系。2006年的一項關于半胱天冬酶激活和募集域4(CARD4)/NOD1的研究結果表明，農場環境對過敏有著強大的保護作用，但只存在于擁有CARD4/-21596T等位基因純合的兒童，攜帶次要等位基因(C)的兒童則沒有。在前者中，生活在農場環境中的孩子對花粉的敏感性、發生過敏性鼻炎和特應性哮喘的概率要顯著低于生活在非農場環境中的兒童。相反，在CARD4/-21596中具有等位基因C的孩子中，沒有發現不同環境暴露狀態所致的這些表型的流行病學差異。過敏易感性和TLR2、TLR4以及CD14基因的表達由母親懷孕期間的暴露決定，而當前的暴露作用很少或者基本沒有作用。在這些基因上調程度和PARSIFAL招募的母親在懷孕期間遇到的不同農業環境動物的數量之間發現了劑量–反應關系。攜帶CD14/-1721A等位基因的兒童在過敏性疾病中牛奶攝入的保護作用要強于G等位基因純合子。

在PASTURE的研究中，臍帶血中先天性免疫受體的表達在農村的新生兒中較高，TLR7和TLR8的差異尤其顯著，出生后第一年非煮沸牛奶的攝入與TLR4、TLR5和TLR6 mRNA表達有著強相關性。然而，并沒有發現之前描述的通過單核酸多態性CD14/C-1721T的CD14基因表達與農場牛奶攝入之間有關聯修飾。母親懷孕期間接觸三個或更多農場動物物種的兒童發生特應性皮炎的風險要降低超過一半，并且TLR5和TLR9在臍帶血中表達升高和特應性皮炎醫生診斷的減少有關。此外，特應性皮炎觀察到TLR2多態性和產前貓接觸有顯著關系。最后，參與PASTURE研究隊列的母親母乳中的sIgA水平與微生物載量相關的環境因素有關，如它們與母親懷孕期間的農場動物或者貓接觸有關，但是與原奶的攝入無關。此外，sIgA水平與直至2歲兒童的特應性皮炎呈負相關。總而言之，這些研究結果強烈提示農場環境暴露(包括動物暴露和原奶攝入)與早年個體先天性或者sIgA免疫應答之間有著微妙的相互作用，而腸道微生態被認為起著核心作用。

第二組證據來自早期建立的免疫調節機制，包括樹突狀細胞、Treg細胞和調節性細胞因子，以及暴露于農場環境兒童的Th1反應。

大部分免疫研究觀察到的結果已經在前文有所敘述。PASTURE中芬蘭人群的流行病學調查證實了另一研究結果，在農場環境生活兒童的未激活單核細胞與非農場生活兒童相比，產生更多的IL-10、IL-12和IFN-γ，并且特定的農場環境暴露與較多的細胞因子自發性產生相關。特定農場環境暴露的數量傾向于和更高的IFN-γ自發性產生、更低的LPS誘導TNF產生呈劑量依賴性相關。來自同一兒童亞組的觀察結果表明，先天性與獲得性免疫之間存在聯系，通過鑒定農場與非農場環境生活的兒童的樹突狀細胞所得以上結論。

在4.5歲時，哮喘與體外骨髓樹突狀細胞(mDC)CD86表達呈正相關，與LPS刺激后的mDC的IL-6產物呈負相關。LPS刺激導致來自農場環境生活兒童細胞培養物中mDC的百分比較低，這表明來自農場環境暴露可能通過降低mDC的百分比以具有免疫學效應。同一批兒童在6歲時，BDCA3⁺高2型mDC(mDC2)的百分比在農場環境生活兒童中較低；mDC2百分比與產前和終生農場牛奶、馬廄暴露有類似的關聯，雖然這些關聯在農場環境中并非獨立存在。在PASTURE研究中獲得的結果也提示了飲食的互補和獨立效應：在出生后第一年，輔食多樣性增加與劑量–反應效應的哮喘呈負相關，并且在食物過敏食物致敏中觀察到類似的結果。

此外，食物多樣性的增加和FOXP3表達增加與Cε種系轉錄物(編碼LgE的重鏈)表達降低呈顯著相關。已經進行了共生細菌[如產氣莢膜梭菌(C.perfringens)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、鼠李糖乳桿菌、大腸桿菌(E.coli)和脆弱類桿菌]干預新生兒臍帶血單核細胞與樹突狀細胞的能力的體外實驗。革蘭陽性菌如產氣莢膜梭菌和金黃色葡萄球菌誘導了可溶性CD14(Scd14)從單核細胞的釋放，而革蘭陰性菌則不能。然而，革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均誘導樹突細胞sCDS的釋放。反過來，sCD14和sCD83通過抑制IL-13的產生來抑制樺樹花粉過敏原誘導的Th2的分化。

另一項使用青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、糞球腸菌(Enterococcus faecalis)、植物乳桿菌(L.plantarum)、緩癥鏈球菌(Streptococcus mitis)、極小棒桿菌(Corynebacterium minutissimum)、產氣莢膜梭菌、普通擬桿菌(Bacteroides vulgatus)、大腸桿菌、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、極小韋永氏球菌(Veillonella parvula)和干燥奈瑟菌(Neisseria sicca)的體外實驗表明，不同的菌株對嬰兒免疫系統的成熟產生不同的影響。在臍帶細胞和成人細胞中，革蘭陽性菌產生的IL-12和TNFα比革蘭陰性菌產生的水平高，但是臍帶細胞中革蘭陰性菌產生的IL-6和IL-10水平與革蘭陽性菌相似。植物乳桿菌通過CD14、TLR2和TLR4信號傳導，而大腸桿菌主要通過CD14和TLR4傳導。已知的早期誘導和維持調節機制受腸道微生態強烈影響，提示在農場環境中腸道微生態的干預對免疫系統成熟具有促進作用。

（一）尋找“農業替代品”：益生菌的應用

應用對宿主起有益作用的益生菌制劑調節腸道菌群的生態平衡，是目前孕期及嬰幼兒出生以后第一個月預防過敏性疾病發生的主要措施。2001年Kalliom?ki等在研究發現過敏與非過敏兒童的腸道菌群組成不同之后進行了一項運用益生菌LGG對妊娠母親和過敏風險高的嬰幼兒進行干預的前瞻性雙盲隨機試驗。本文的目的并不是要對40多個益生菌臨床試驗進行詳細論述，并且Forsberg等、Zuccotti等、Cuello-Garcia等、Zhang等的綜述及Meta分析已經對益生菌臨床試驗的細節有過詳細描述。各種乳桿菌或乳桿菌與雙歧桿菌聯合使用的結果表明，其對呼吸道過敏性疾病沒有顯著的保護作用；然而與安慰劑對照組相比，益生菌可以顯著降低特應性皮炎的相對風險，當益生菌聯合使用或者圍產期聯合干預時這種保護效應最為顯著。世界過敏組織(WAO)-麥克馬斯特大學過敏性疾病防治指南也參考了這個結論——使用益生菌干預可能對于濕疹的預防有一定的益處；然而該指南也指出，這些指南推薦都是有條件的，并且證據質量和證據級別都比較低。因為證據級別非常低，考克蘭協作組并不推薦使用益生菌預防過敏性疾病。

益生菌能夠選擇性地刺激腸道菌群的活性或生長繁殖，從而增進宿主健康，但其臨床應用價值比較有限。七項關于低聚半乳糖和低聚果糖的元分析結果并不一致，因此不作任何推薦。

（二）“農場藥物”或“農場疫苗”的研發

在過去10年中，受到流行病學研究的啟發，研究人員已經對從農場粉塵當中提取的可用于預防過敏的微生物及其組分進行了大量的實驗研究。為了進一步探討其作用機制，氣道過敏小鼠模型已用于研究這些微生物及其組分的抗過敏性質。卵清蛋白致敏的小鼠吸入粉塵提取物之后，可以抑制小鼠的氣道高反應性和嗜酸性粒細胞增多，同時降低具有抗原特異的IgG-1、IgE及脾細胞分泌的IL-5的水平。體外實驗證實其同樣可以抑制人樹突狀細胞的生成。長期暴露于牛棚粉塵提取物可以誘導樹突狀細胞分泌IL-10，從而降低其誘導過敏反應的能力。牛棚粉塵中黃粉蟲幼蟲的中腸的絲氨酸蛋白酶可以誘導在呼吸道過敏性疾病中起調節作用的配體即補體因子C5a的釋放。

在所有的非細菌組分當中，阿拉伯半乳聚糖是一種從牛棚粉塵和植物中分離到的多糖，并且在飼料中尤其是在牧草狐尾草(Alopecurus pratensis)中含量特別豐富，該物質是通過色譜法和特定試劑沉淀分離得到后，再通過核磁共振光譜法進行分析鑒定的。從牧草中提取的阿拉伯半乳聚糖對小鼠特應性致敏、過敏性氣道炎癥和氣道高反應性具有保護作用。此外，用提取自牧草的阿拉伯半乳聚糖處理后可誘導鼠樹突狀細胞分泌IL-10，從而抑制其誘導過敏性免疫應答的能力。這種從牧草中提取的阿拉伯半乳聚糖對過敏的保護作用似乎具有一定的特異性；用從樹脂中提取的阿拉伯半乳聚糖和從落葉松中提取的阿拉伯半乳聚糖進行對照實驗發現它們對過敏并沒有保護作用，利用核磁共振光譜發現它們與從牧草中提取的阿拉伯半乳聚糖的結構不同。最近有研究表明口服來自益生菌的D-色氨酸具有抗過敏和免疫調節效應。補充D-色氨酸也增加了患氣道過敏性疾病小鼠的腸細菌群的多樣性。但據我們所知，這些研究成果目前還沒有應用于預防過敏性疾病。

從農場分離到的細菌中被廣泛研究的細菌主要有魯氏不動桿菌(A.lwoffii)F78、乳酸乳球菌(L.lactis)G121和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)。ALEX研究基于這些細菌在牛棚微生物中的相對豐度以及生活于農場環境的兒童血清中存在的特異性血清抗體，從來自農場的100多種不同的菌株中篩選出上述菌株。研究表明地衣芽孢桿菌孢子可以減少哮喘小鼠肺組織中的嗜酸性粒細胞數量及杯狀細胞增生，但可以引起中性粒細胞聚集，因此不太可能應用于臨床治療。魯氏不動桿菌F78和乳酸乳球菌G121能夠降低小鼠的過敏反應，在樹突狀細胞中可以誘導Th1細胞極化。魯氏不動桿菌F78可以誘導Th1/Th2細胞轉錄因子TBet/GATA3的表達，而且是由革蘭陰性菌中的內毒素所誘導的。由乳酸乳球菌G121介導的過敏保護效應依賴于樹突狀細胞中的內體酸化，乳酸乳球菌G121誘導小鼠單核細胞分泌細胞因子可能是通過活化TLR13信號通路介導的。乳酸乳球菌細胞膜上的脂磷壁酸可能是其發揮抗過敏效應的主要成分，但其并不誘導TLR2和TLR4的表達。母親對后代抗過敏效應的遺傳性同樣被證實，TLR2/3/4/7/9敲除的純合子母鼠經過魯氏不動桿菌F78處理后，益生菌對哮喘的預防作用在其雜合子代小鼠體內完全喪失。母親攝入益生菌魯氏不動桿菌F78后，可通過促進組蛋白(H4)乙酰化的表觀遺傳學機制來提高CD4⁺T細胞的IFN-γ表達水平，從而對其子代起到保護效應。

在PARSIFAL研究中，松鼠葡萄球菌(S.sciuri)W620是使用了PCR-SSCP方法以及電泳技術從農場床墊收集的灰塵當中篩選出來的。將具有特定條帶的凝膠割膠回收并測序以鑒定細菌的種屬，用PCR-SSCP方法證實了魯氏不動桿菌與其抗過敏效應的相關性。該研究還證實了地衣芽孢桿菌屬、乳桿菌屬與兒童哮喘呈顯著負相關。在由Th2介導的的卵清蛋白致敏小鼠模型和Th1、Th2共同介導的塵螨動物模型中證明了松鼠葡萄球菌W620對哮喘的保護效應。在塵螨動物模型中，淋巴細胞分泌Th1和Th2細胞因子的水平平行降低。松鼠葡萄球菌W620與樹突狀細胞共培養后，激活了TLR2和NOD2受體，啟動樹突狀細胞分化成熟。盡管IL-12p53mRNA轉錄的缺失導致IL-12的產量不足，但是暴露于松鼠葡萄球菌W620的樹突狀細胞仍可選擇性地促進共培養的T細胞釋放Th1細胞因子，并且這其中也有IL-23的貢獻。

從人體內實驗和動物實驗的結果得出人類的實際預防措施是一次令人振奮但困難的努力。根據上述臨床前動物試驗以及使用益生菌干預的人體臨床試驗所得到的癥狀緩解結果，我們可以從中獲得一些值得探討的要點。

首先，顯然從體外結果轉到動物體內試驗結果，再推測得到人類的臨床結果是很困難的。

其次，要考慮的是給藥途徑，這可能是如何將流行病學觀察結果轉化為人類治療或預防措施的關鍵因素：為了更好地進行臨床前動物模型研究和探索樹突狀細胞的保護作用，應該運用鼻內給藥。然而，農場粉塵來源的細菌對腸道微生態的影響及其鼻道途徑還沒有被研究。

再次，要考慮細菌多樣性對“農場環境”的整體影響，以及每種物種或菌株通過多種受體和通路類型來發揮抗過敏效應：研究細菌的混合物和(或)它們的成分是非常吸引人的，測試它們的用途和研究其可能的相互作用的實驗方法一直在發展。

然而，這項工作仍面臨一些阻礙，包括如何以工業規模生產每種成分；分析工具的可能性與準確性，這些分析工具用來控制和確保最后混合物每個成分的質量和穩定性；以及因為不同的成分的相互作用和不同成分與不同細胞以級聯方式產生相互作用，而增加副作用的風險。這種風險對于治療嚴重疾病是可接受的，但其對于健康兒童的預防性治療是不可接受的。

此外，如果使用有機生命體，由于宿主的免疫抑制狀態，非病原體試劑轉變成對其有害病原體的風險還是存在的。這些阻礙的綜合隨即引起了工業和倫理方面的爭議。為了未來保護遠離農場環境的兒童免受過敏性疾病的侵害，我們應該聯合微生物學家、免疫學家、生物工程師、兒科醫生、過敏癥專家、臨床試驗專家以及倫理委員會的專長共同應對挑戰。

注：本文內容呈現略有調整，若需可查看原文。

改編原文：

Dominique Angèle Vuitton, Jean-Charles Dalphin.From Farming to Engineering: The Microbiota and Allergic Diseases[J].Engineering,2017,3(1): 98-109.