在微生物配體刺激下，巨噬細胞中l(wèi)ncRNA-EPS表達下調(diào)；
lncRNA-EPS抑制免疫應(yīng)答基因表達；
lncRNA-EPS通過調(diào)控核小體重定位抑制免疫應(yīng)答基因轉(zhuǎn)錄；
lncRNA-EPS缺陷小鼠免疫炎癥表型明顯；
主要內(nèi)容：
LincRNA-EPS是一個免疫調(diào)控lincRNA，在巨噬細胞中被精確調(diào)控，來控制免疫應(yīng)答基因（IRGs）的表達。EPS缺乏小鼠在內(nèi)毒素攻擊后表現(xiàn)出炎癥與致死率增加。EPS定位于IRGs調(diào)控區(qū)，控制核小體定位并抑制IRGs轉(zhuǎn)錄。EPS通過位于3’端的CANACA模體作用于核不均一核糖核蛋白L來介導(dǎo)這些作用。
1、巨噬細胞在微生物配體刺激下EPS水平受到抑制-這表明炎癥狀態(tài)下EPS下調(diào)的
首先，我們先了解以下的一些信息：
a、巨噬細胞屬于免疫細胞,是細胞和分子免疫的重要研究對象.。
b、TLR是參與非特異性免疫的蛋白分子，屬于內(nèi)源性配體。
c、IRGs免疫反應(yīng)基因，由免疫反應(yīng)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的多種支配免疫反應(yīng)的蛋白。
“在靜息的細胞中，NF-kB 和IkB形成復(fù)合體，以無活性形式存在于胞漿中。當細胞受細胞外信號刺激后，IkB激酶復(fù)合體（IkB kinase, IKK）活化將IkB磷酸化，使NF-kB暴露核定位位點。游離的NF-kB迅速移位到細胞核，與特異性kB 序列結(jié)合，誘導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。”
“TLRs能激發(fā)NF-κB信號通路改變基因的表達。”
上述內(nèi)容是該部分實驗的背景基礎(chǔ)。
作者使用TLR2刺激巨噬細胞后，通過RNA測序確定了下調(diào)的lincRNA-EPS，而EPS在靜息的巨噬細胞中是高表達的，那么作者認為EPS可能調(diào)控了IRG表達。并且驗證EPS下調(diào)作用依賴于MyD88、Trif共同作用。
接下來，作者選擇了一個IKK激酶（NF-kB抑制蛋白）抑制劑，發(fā)現(xiàn)LPS（TLR4）介導(dǎo)的抑制EPS水平能力減少了。并且IL-1α（NF-kB通路靶標蛋白）的mRNA水平與EPS表達呈負相關(guān)。
這部分實驗驗證非常精妙，通過IKK抑制劑處理后，免疫蛋白分子LPS對EPS抑制表達作用減低，這塊說明了NF-kB激活，并參與調(diào)控，后面IL-1alpha水平降低，也證明了NF-kB通路激活。
可以看這個小圖
接下來，作者使用外源性生物（能引發(fā)免疫）仙臺病毒、李斯特菌處理BMDMs細胞，或使用TNFa、IFN干擾素刺激細胞，誘發(fā)免疫反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)EPS下調(diào)了。這說明了在巨噬細胞中EPS受到微生物以及炎癥觸發(fā)調(diào)控。
2、在巨噬細胞中，EPS缺失能增強IRGs表達-這部分內(nèi)容跟上述內(nèi)容是個對比
EPS缺失細胞使用LPS刺激后有多種基因表達發(fā)生了變化，并呈現(xiàn)時間增加。通過基因功能分析，發(fā)現(xiàn)上述多種差異表達的基因中，有多種免疫防御相關(guān)作用IRGs都過表達了。并且隨著時間的推移，差異表達的免疫基因數(shù)量上升了。這些免疫基因中，表達顯著提升的主要是細胞因子及趨化因子，干擾素刺激基因（ISGs）以及鳥苷酸結(jié)合蛋白（GBP）。
作者關(guān)注了5號染色體上的IRGs簇（Cxcl10, Ccl5,IL6），在EPS缺失的BMDMs細胞中是上調(diào)的。
3、根據(jù)上述內(nèi)容，可推斷，在巨噬細胞中，EPS作為炎癥反應(yīng)的負調(diào)控因子
異位表達的EPS，能顯著減少由LPS誘導(dǎo)表達的IRGs，包括細胞因子，趨化因子，抗病毒ISGs。
功能獲得與恢復(fù)實驗表明，EPS能負調(diào)控IRGs。
ASC在炎癥部位高表達增高，其含有一個caspase富集域。ASC參與caspase-1活化，調(diào)控細胞凋亡。
ASC是組裝炎性體的關(guān)鍵適配蛋白，而炎性體是caspase-1激活復(fù)合體，能控制IL-1beta成熟。ASC-Nlrp3-caspase1-IL-1beta
激活Nlrp3炎性小體能改變細胞表達EPS。
IL-1beta是一類細胞因子，它作為一個原蛋白由激活的巨噬細胞產(chǎn)生。能被caspase1水解成激活形式。它是很重要的一種炎癥反應(yīng)中間體，參與細胞的很多生理功能包括細胞凋亡。
尼日利亞菌素或E.coli能激活Nlrp3.作者通過實驗發(fā)現(xiàn)
EPS缺失+LPS+nigericin/E.coli能上調(diào)IL-1beta，IL-1beta能激活炎癥反應(yīng)。
而nigericin/E.coli能激活Nlrp3。所以上述過程可以表示成為EPS缺失的細胞通過LPS處理，激活炎性小體Nlrp3（ASC上調(diào)，ASC是組裝炎性體的關(guān)鍵適配蛋白），隨后IL-1beta表達提升，促發(fā)炎癥反應(yīng)。結(jié)合前兩部分內(nèi)容，表明EPS與炎癥反應(yīng)負相關(guān)。
4、在靜息巨噬細胞中，EPS與染色質(zhì)關(guān)聯(lián)著的-引出調(diào)控IRG原因
首先，作者發(fā)現(xiàn)EPS主要定位于細胞核中。那么為了驗證EPS是游離于核漿中，還是關(guān)聯(lián)在染色質(zhì)片段上面，作者通過化學的方法將內(nèi)源性染色質(zhì)-RNA復(fù)合物固定住，最后實驗發(fā)現(xiàn)隨機選擇的3組片段上，都檢測到了EPS。最后做了下驗證，組蛋白RIP實驗?zāi)芾翬PS，表明了EPS與染色質(zhì)關(guān)聯(lián)。
5、EPS抑制IRGs的染色質(zhì)態(tài)來控制后者的表達-驗證第四部分的結(jié)果
通過ChIP實驗發(fā)現(xiàn)，缺乏EPS的細胞，RNA聚合酶II在IRGs轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)水平提供，表明了EPS控制IRGs表達是通過轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。
所以作者認為有可能EPS參與表觀調(diào)控IRGs來抑制后者的基礎(chǔ)表達。
作者通過ChIP-qPCR來檢測組蛋白3的4號賴氨酸三甲基化水平(H3K4me3，它是轉(zhuǎn)錄起始位點附近的轉(zhuǎn)錄激活標志物，會受到EPS的抑制)。試驗發(fā)現(xiàn)，在EPS缺失的情況下，靜息狀態(tài)或LPS刺激的細胞中，H3K4me3水平都增加了。----這邊說明了EPS缺失能引發(fā)轉(zhuǎn)錄激活
接著作者檢測了聚合酶II的絲氨酸磷酸化水平（它是轉(zhuǎn)錄激活與開始進行的標志物），試驗發(fā)現(xiàn)，缺乏EPS并通過LPS刺激下，細胞中IRGs轉(zhuǎn)錄啟動子附近的聚合酶II絲氨酸磷酸化水平得到顯著的提升。-----這邊說明了EPS缺失能引發(fā)轉(zhuǎn)錄
“RAP技術(shù)：將與目標RNA互補的寡核苷酸進行生物素標記，并由此捕獲相關(guān)蛋白，隨后可以鑒定捕獲的蛋白。”
作者通過RAP實驗驗證了EPS是結(jié)合到IRGs的基因位點上的，從而抑制IRGs的表達。
“染色質(zhì)可接近性：染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化可以調(diào)節(jié)基因的表達。基因表達活躍的區(qū)域，染色體結(jié)構(gòu)較為疏松，.組蛋白乙酰化通常發(fā)生在蛋白質(zhì)的賴氨酸，中和賴氨酸上的正電荷，增加組蛋白與DNA的排斥力，使得DNA結(jié)構(gòu)變得疏松，從而導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄活化。來闡明染色質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用的作用,關(guān)鍵是要確定染色質(zhì)可接近性，一般來說,染色質(zhì)越緊密,就越難以對轉(zhuǎn)錄因子和其他DNA和DNA結(jié)合蛋白質(zhì)來發(fā)揮作用。DNA越容易接近,周圍的基因就越有可能參與轉(zhuǎn)錄。核小體的存在(或缺乏)直接或間接地影響各種細胞與代謝過程,如重組、復(fù)制、著絲粒的形成和DNA修復(fù)。”
“ATAC-seq是采用高通量測序法對易接近轉(zhuǎn)座酶核染色質(zhì)的化驗。 ”
作者通過ATAC-seq技術(shù)，表明了在一般情況下，EPS促進核小體占據(jù)靶標IRG啟動子區(qū)附近，影響該部分的染色質(zhì)松散性（可接近性），來抑制IRG轉(zhuǎn)錄。
6、發(fā)現(xiàn)核不均一核糖核蛋白hnRNPL與EPS結(jié)合，并調(diào)控IRGs轉(zhuǎn)錄
作者發(fā)現(xiàn)hnRNPL能作用與EPS。并且沉默掉hnRNPL能提升IRG的表達（包括mRNA、蛋白水平）。這表明了hnRNPL與EPS結(jié)合來調(diào)控IRG的表達。
隨后作者發(fā)現(xiàn)并驗證了EPS與hnRNPL的結(jié)合部位。
7、反向說明存在EPS能抑制體內(nèi)的炎癥反應(yīng)
前面都是基于細胞水平的實驗，最后這一部分，作者通過建模小鼠，來驗證存在EPS能抑制體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。
在小鼠多組織中發(fā)現(xiàn)，EPS能有效抑制多種炎癥因子的表達。并且，EPS的表達有效抑制小鼠的致死率。
