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拿出紙筆，且聽小銳說事兒.......

Nature于今年7月6日緊隨Science4月29日的特刊，推出業內頂級專家主筆的6篇有關“腸道菌群-宿主相互作用”的重量級綜述和觀點透視專輯，提供了腸道菌群在多個領域的和臨床應用發展中的重要進展。本期專輯的推出，為腸道菌群和腸道健康的研究和轉化再一次搖旗吶喊。宏基因組關聯分析（MWAS）作為微生物組研究的一把利器，正在微生物與疾病研究中發揮越來越重要的作用。今天小銳說事兒便跟大家聊聊6篇雄文中的一篇來自微生物研究領域大牛Jack A. Gilbert（美國環境、醫院和家庭微生物組計劃發起人，點擊名字查看教授簡介）主筆的綜述文章，有關宏基因組關聯分析在疾病領域的研究進展。

文章主旨

本綜述總結了疾病相關生物學過程中微生物的作用，并詳細介紹了宏基因組關聯分析（MWAS）方法以及它在關聯微生物與疾病表型中的研究成果。

MWAS與GWAS的異同點

從概念上來說，宏基因組關聯分析（MWAS）與全基因組關聯分析（GWAS）的確有共同點，都是將某些復雜的特征（比如物種或基因）與表型關聯起來。但是，這兩者之間存在以下幾個非常重要的區別：第一，微生物中的基因數量與人的基因數量比值接近100:1；第二，幾乎所有的個體都具有相同的基因，但所攜帶的微生物種類和基因差異巨大；第三，人體的基因表達量很容易計算，而大部分微生物組數據只能通過相對豐度進行量化。因此，微生物組分析很有難度；第四，人體基因組是不會改變的（除癌癥等特殊情況），而個體所攜帶的微生物組在不斷變化。

快速了解MWAS

1.MWAS能夠將物種注釋到種水平，對基因進行預測及功能注釋，另外還有少部分轉錄本和蛋白相關的分析。

2.宏基因組測序和組裝

為確保樣品間的比較有意義，首先應保證足夠測序數據量，因為被檢測到的基因數會隨著測序數據量的增加而增加，直到飽和。與從腸粘膜、口腔、皮膚、陰道和胎盤這些部位采集的樣品相比，糞便樣品宿主污染比較少，不超過總數據量的1%。經過質控，測序得到的序列（reads）被重新組裝成更長的序列（contigs），這些contigs共同組成宏基因組。

3.微生物參考基因集

通過對組裝后的contigs進行基因預測，并去除樣品間高度相似的基因序列，得到非冗余基因集。基因的豐度、分類和功能都是基于這個參考基因集而被量化，從而進行微生物與疾病之間的關系研究。因此，建立一個高質量的參考基因集是MWAS的基礎。

4.基于宏基因組數據的分類

不同樣品中來自相同微生物基因組的一類基因應該具有相同的豐度變化模式，可根據這一原理對宏基因組數據集中的基因進行聚類，將物種分辨率提高到菌株水平。基于不同的相關系數和算法，這些聚類方法包括建立MLG（metagenomic linkage groups）、MGC（metagenomic clusters）或MGS（metagenomic species）。在物種注釋時，基于保守的單拷貝基因和基因組的菌株特異性區域進行比對非常有效。例如，宏基因組操作分類單元法（mOTU）就是基于十個保守的單拷貝基因進行物種注釋，因此，比利用16S rDNA在物種比對上更準確。

5.MWAS對微生物組的分析是基于整體的概念，采取降維的思想，將多維因素下數據的差異展示在二維坐標上。一般通過聚類分析、主坐標分析（PCoA）、主成分分析（PCA）、一致性分析、因子分析和判別分析來實現降維。

圖1. 通過MWAS關聯微生物與疾病

微生物在疾病領域研究進展

MWAS是通過研究特定環境中的微生物將疾病與微生物關聯起來。那目前疾病領域微生物研究進展如何？我們一起來回顧一下。

微生物標記物

現在大部分的研究都是通過鑒定微生物群落結構的改變來區分患病風險人群與健康人。

（1）微生物多樣性分析

很多疾病研究都是基于微生物群落的相似性來區分不同的樣品。然而，度量標準，如統計學模型的選擇對結果的影響很少受到重視。對于一組特征多樣化的樣品，例如，來源于不同人群的皮膚樣品，即使通過統計學模型能夠揭示原始數據的差異，但很有可能這種差異與生物學上的差異不一致。另外，從微生物復雜的潛在作用關系中提取出與研究相關的網絡至關重要。比如鑒定出克羅恩病患者體內有益和有害的微生物相互作用關系。但這種方法存在兩個問題：第一，通過多項分布得到的個別微生物的富集會產生很多負相關關系，從而引起網絡拓撲結構的偏好性；第二，分類數據非常稀少，某個特定微生物在大部分樣品中沒有富集。在物種注釋方面，宏基因組學比擴增子測序更精確。不過，通過寡核苷酸配型技術（oligotyping）對16S rDNA測序數據進行再分析，能夠提高物種鑒定的分辨率。然而，不是分辨率越高分類結果就越準確，比如16S rDNA分析中分類到種水平的OTU在區分胖人與瘦人時的準確性反而有所降低。

（2）功能分析

宏基因組學通過對特定環境中所有的DNA片段進行測序，故能夠提供更完整的微生物群落信息以及很多更強大的分析。比如對物種的鑒定到菌株水平或單核苷酸多態性(SNPs)，基于KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)、COG (Clusters of Orthologous Groups of Proteins)、GO (Gene Ontology)和EggNOG (Evolutionary Genealogy of Genes: Non-supervised Orthologous Groups)等數據庫對DNA序列進行功能聚類。

結合人類宏基因組與代謝組學數據在區分不同疾病特征方面很有優勢（圖2），除了能夠提高物種鑒定的分辨率，也有助于揭示某現象的潛在機理，比如解釋糞菌移植艱難梭菌如何改變小鼠膽汁酸代謝產物的研究。宏蛋白質組學也可以鑒定新的生物標記物，已有報道稱乳酸脫氫酶、精氨酸脫亞胺酶以及參與胞外多糖合成、鐵代謝和免疫應答過程中的酶，能夠作為健康人口腔環境中的標記物。結合宏基因組學、代謝組學和蛋白質組學已經揭示出微生物如何應對特定的疾病狀態，比如IBD，并找到參與丁酸鹽和膽汁酸代謝過程中的特定物種（例如Faecalibacterium、prausnitzii）、蛋白和代謝產物，這些均可作為區分克羅恩病引起的回腸炎癥、結腸炎癥以及健康人腸道的生物標記物。

Nature. 2016 Jul 6;535(7610):94-103

圖2. 人類微生物組的代謝產物來源

MWAS在微生物-疾病研究中的成果

表1. 宏基因組關聯分析在疾病領域的研究成果

Nat Rev Microbiol. 2016 Aug;14(8):508-22.

從相關關系到因果關系

想要明確疾病的發病機理，僅停留在微生物與疾病的相關關系上遠遠不夠。到目前為止，最大的挑戰就是超越微生物與疾病狀態的相關性，建立它們之間的因果關系。case–control模型的限制就是不能確認是微生物群落的變化引起疾病，還是疾病引起了微生物群落變化，又或是這兩者作為混合因素引起了兩者狀態的改變。

目前的幾個用于鑒定微生物與疾病因果關系的研究方法均存在優勢與缺陷。縱向研究，比如CHILD（Canadian Healthy Infant Longitudinal Development）出生隊列研究，能夠檢測微生物的變化在疾病發生之前還是之后，然而這項研究非常昂貴，且需要大量的人群樣本。干預研究可以通過藥物管理或其它干預方式來引起微生物和疾病表型的改變，這種方法非常有效，但存在倫理問題。比如糞菌移植就面臨很多障礙，尤其在美國。另外，人群樣本很難采集，并存在很多隱私問題，特別是有些樣本被用于很多不同的研究。動物模型雖然在探究疾病發生機理方面有很大的應用價值，但這些機理與人類疾病之間的關系還有待明確。

代謝組揭示重要的微生物活動

由于代謝過程的變化非常快，能夠同時揭示出宿主和微生物的生理狀態，代謝組生物標記物在疾病診斷方面具有重要作用。人體微生物組所產生的小分子由四組構成。第一組是分解代謝和合成代謝產生的初級代謝物，主要用于細胞生長和維持體內穩態。第二組包含一些特定代謝物，包括毒力因子、二級代謝物和自然產物。研究二級代謝物的變化可以幫助人們理解食物中的毒素、群體感應和有益的代謝物。第三組是宿主產生的代謝物或受到微生物酶修飾而產生的化學產品。研究第三組代謝物的變化，有助于理解微生物如何影響宿主的代謝產物。第四組是個人護理產品、藥物干預、食物或外界環境作用下所產生的化學過程和代謝產物。研究第四組代謝物的變化有利于理解這些化合物是怎樣作用于機體從而引起有害反應或其它形式的變化。

越來越多的研究表明微生物的代謝物能夠直接影響人體健康，例如 SCFAs（短鏈脂肪酸）對IBD發生、發展的影響。MassBank、METLIN、MetaboLights和HMDB（the Human Metabolome Database，人類代謝組數據庫）等數據庫依次出現，旨在儲存和傳播質譜分析獲得的數據，使得更多代謝物被注釋。無菌動物的使用在鑒定宿主微生物所產生的初級代謝物中具有重要作用，但很多代謝物在人類健康中的作用還有待研究。另外，微生物的致病要素可能是編碼特定代謝物的基因，而非致病物種的核心基因（圖2）。因此，微生物相關疾病的研究也可以從研究這些基因的角度出發。

值得一提的是，除了宏基因組和代謝組學數據，宏轉錄組、環境蛋白質組可通過研究疾病人群微生物中顯著富集的RNAs和蛋白質進一步為微生物-疾病之間的關系提供依據。人體腸道菌群在對藥物功效和毒性的調節中發揮重要作用。個體微生物的差異使得個體服藥后所引起的代謝不同從而導致個體間有效藥物劑量和副作用的不同。在服用伊立替康治療結腸癌的病人中，40%病人的治療療效因微生物相關的藥物毒性而降低。研究發現，這種藥物毒性產生與一種微生物的β-葡萄糖醛酸酶相關，目前通過抑制這種酶來調節微生物活性的抑制劑正處于臨床實驗階段。因此，為全面理解人體微生物組在健康和疾病中的作用，多組學工具的應用非常重要。

什么是健康的微生物組

與疾病人群相比，宏基因組關聯分析在健康人中鑒定出的細菌種類和功能能夠作為一個健康的微生物組的部分特征（表1）。其中，產生短鏈脂肪酸的細菌，如R. inulinivorans和F. prausnitzii在很多疾病相對應的健康人樣本中均發生富集，包括II型糖尿病和肥胖。擬桿菌屬的微生物在順產和母乳喂養嬰兒中豐度最高，而在很多健康人和疾病人群中也顯著富集。一方面，擬桿菌屬的細菌能夠幫助代謝植物中的糖，給宿主提供營養；另一方面，這些細菌也會產生毒素，這可能對結腸癌的發展產生影響。同樣地，盡管Lactobacillussa livarius和Bifidobacterium dentium被認為是對免疫系統有益的物種，但在類風濕性關節炎患者中發現這兩種細菌顯著富集。因此，對這些物種在菌株水平進行鑒定，有助于闡明它們在人類疾病與健康中看似矛盾的作用。

與在物種分類水平相比，健康人和疾病人群的分類依據在功能水平更明確。在腸道的缺氧環境中，抗氧化應激能力的增強標志著腸道菌群失衡，同時也表示好氧細菌的增加或者宿主免疫系統被激活。另一個腸道菌群失調的標志是硫酸鹽或亞硫酸鹽向硫氰化物的轉換。從某種程度上來說，短鏈脂肪酸丁酸鹽和丙酸鹽等代謝物是腸道上皮細胞能量的主要來源，能夠幫助維持一個健康的腸道環境，如MWAS參與的II型糖尿病、肥胖和結腸癌腸道菌群研究。

發展一個微生物全球定位系統

Nature. 2016 Jul 6;535(7610):94-103

圖3. 微生物全球定位系統對疾病人群的分層以及指導其治療

未來基于MWAS技術對微生物組在相關疾病中作用的研究會越來越深入，科學家們希望能夠發展一個微生物全球定位系統來對疾病人群進行分層，指導精準醫療，從而維護人類健康（圖3）。

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供稿：閆琨

編輯：閆琨

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