小組介紹
小組：旱傘草下好乘涼
組員：朱宛瑩 白新明 歐祥卉 賈劍銘 盧俊潔 鄭雨露
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Q：你們在了解無融合生殖的課題時有遇到什么困難嗎？你們怎么克服的呢？
A：大家都覺得讀文獻最難的還是翻譯。比如神秘的“蛋細胞”（egg cells），其實就是我們熟悉的卵細胞，“沃肥”（Fertilization）實際上是受精。書讀百遍，其意自現(xiàn)，解決方法就是反復捉摸，讀多了就會克服語言障礙，一點點解開完全不能理解的文字，最終發(fā)現(xiàn)，復雜的線團里面，其實藏著簡單而清楚的邏輯。
Q: 你們有什么收獲和感想嗎？
當然，我們對科學研究的基本方法，嚴謹邏輯，和創(chuàng)新態(tài)度都有了更深刻的認識。無融合生殖非常有趣，它聽起來像個美好的童話，知道自然界中其實有很多這樣的現(xiàn)象后，又會覺得這也沒那么難。但深入了解了科學家們?nèi)绾瓮ㄟ^一點一點艱苦的探索，才揭開了這條有性和無性生殖之間的神秘通路時，就會明白這是一項解民生之多艱的偉大研究，而真正的研究者，會將論文寫在祖國的大地上。我們也應該更多的了解實際，將研究變得腳踏實地，而不是飄在天上。
01
背景介紹
俗話說民以食為天，回顧農(nóng)業(yè)發(fā)展的歷史，第一次綠色革命通過將作物的高稈變矮稈，解決了19個發(fā)展中國家糧食自給問題。而我們今天的主角“無融合生殖技術(shù)”的研究被科學家稱為一場無性的革命，它的影響將遠超第一次綠色革命開創(chuàng)一個新的紀元。
圖一 雜種優(yōu)勢示意圖
我們都知道雜交品種具有優(yōu)良性狀，但性狀不能穩(wěn)定遺傳。制種工作是特別繁重的，中國水稻研究所研究員王克劍曾說：“對于育種家而言，制種非常辛苦，它不僅要講究郎才女貌、門當戶對，還要講究性格相投、優(yōu)勢互補。這些還不行，還要講究在合適的時間、合適的地點，遇到合適的人。”也就是說制種存在著品種選育難，雜交制種難，種子成本高的三大難題。
圖二 王克劍（左）在觀察水稻生長情況
為了解決這個問題，我們發(fā)明了秈型三系雜交水稻，又研發(fā)出兩系雜交水稻技術(shù)，育種專家還沒有滿足，他們絞盡腦汁要實現(xiàn)一種植物自然繁殖，產(chǎn)生的種子卻是母體遺傳物質(zhì)的精確遺傳復制品。這就要依靠無融合生殖技術(shù)。
圖三 雙受精過程和無融合生殖過程示意圖
無融合生殖是是一種不常發(fā)生、但在植物界普遍存在的生殖現(xiàn)象。在植物界存在的有性生殖、無性生殖和無融合生殖三大系統(tǒng)中，無融合生殖是最缺乏研究而又有特殊價值的一種。
無融合生殖是不經(jīng)過精卵結(jié)合而產(chǎn)生種子的一種生殖方式，獲得的后代與母本植物完全一致，是母本植物的克隆，可隨世代更迭而不改變基因型，性狀也不發(fā)生分離，因此無融合生殖可用于雜種優(yōu)勢的固定。
實現(xiàn)無融合生殖的基本思路是實現(xiàn)減數(shù)分裂向有絲分裂轉(zhuǎn)變和配子不受精的獨立發(fā)育。
今天我們小組就來分享一下
圍繞這幾個步驟逐漸實現(xiàn)
無融合生殖的幾個有趣的研究
02
MiMe品系
首先，我們需要了解一下MiMe品系，MiMe（mitosis instead of meiosis）指有絲分裂代替減數(shù)分裂，MiMe品系的形成是對減數(shù)分裂區(qū)別有絲分裂的3個關(guān)鍵點同時破壞，即把同源染色體之間配對和重組、第一次減數(shù)分裂時姐妹染色單體不分離、一次DNA復制后發(fā)生兩次分裂3個點同時突變，使減數(shù)分裂過程類似于有絲分裂，產(chǎn)生的配子保留了母本所有的遺傳信息，從而完成無融合生殖三要素中最關(guān)鍵的無融合減數(shù)分裂過程，現(xiàn)在已成為無融合生殖的有力“工具”之一。擬南芥是最早成功構(gòu)建MiMe的物種，通過spo11-1、rec8和osd1三基因突變構(gòu)建擬的南芥MIME，是重要的無融合生殖模型。
圖四 擬南芥MiMe品系突變的基因的作用
MIME株系產(chǎn)生的克隆配子的自受精會產(chǎn)生倍性加倍的后代。如圖四所示，在隨后的的幾代中，MiMe的倍性在每一代翻倍，從（A）2n（10條染色體）到（B）4n（20條染色體）到（C）8n（40條染色體），左側(cè)為有絲分裂中期染色體行為圖，右側(cè)為相應的4周齡植物和花朵。
圖五 MiMe品系的傳代倍性加倍
03
解決染色體加倍的途徑之一
要獲得正常的無融合生殖種子，還必須解決染色體加倍的問題。2011年，Rapha?l Mercier團隊在Science上發(fā)表的題為“Synthetic clonal reproduction through seeds”的文章就試圖解決這個問題。該研究發(fā)現(xiàn)了一種染色體消除突變體系GEM，GEM的配子形成合子后會將自己的染色體消解掉，從而實現(xiàn)只保留MiMe的染色體，從而實現(xiàn)阻止染色體的加倍。
圖六 （A）左：正常繁殖 中：無融合生殖 右：克隆體與GEM雜交示意圖（B、C）親本和雜交后代多態(tài)性基因座基因分型的結(jié)果
實驗結(jié)果分析得到，MiMe品系作為母本和GEM系雜交制得的種子后代當中的二倍體中，有98%的植株保留MIME株系的雜合性。而且第一代得到的克隆MiMe和Gem雜交后代性狀也得到了保持，證明通過MIME獲得多代無融合種子是可行的。雖然上述所描述的系統(tǒng)仍依賴于雜交，且存在一些問題，但為無融合生殖的發(fā)展提供了新思路。
圖七 實驗部分結(jié)果分析
04
MiMe品系在水稻中的應用
有了模型是不夠的，只有用進糧食作物才能實現(xiàn)價值。接下來這篇16年Mieulet Delphine團隊發(fā)表在cell resreach的題為“Turning rice meiosis into mitosis”文章就嘗試將模型運用在水稻中。整個研究分為三部分，首先，它擴展了可以突變以創(chuàng)建MiMe表型的基因目錄，然后通過生物信息學的方法定位出水稻中關(guān)鍵OSD1基因的同源物，并制作水稻該基因突變體完成了驗證。最后通過制種和驗證，團隊發(fā)現(xiàn)了水稻中pair1，rec8和osd1突變的組合，和mime品系具有相同的效果，因此，將該品系稱為OsMiMe。實現(xiàn)了在水稻中產(chǎn)生克隆雌性二倍體配子。
圖八 pair1，rec8，osd1突變的水稻減數(shù)分裂
05
BBM1基因啟動胚的發(fā)育
那么如何啟動無融合生殖途徑得到的水稻種子的胚發(fā)育的問題呢？
2018年美國加州大學戴維斯分校Sundaresan研究組發(fā)表在Nature的題為“A male-expressed rice embryogenic trigger redirected for asexual propagation through seeds”的論文發(fā)現(xiàn)，在水稻中，有一個叫做Baby Boom的基因家族。
他們將其中的BBM1和GFP捆綁表達，結(jié)果如圖9-a所示，發(fā)現(xiàn)只有BBM1來自父本，才在受精卵核觀察到GFP表達，也就是BBM1只在精子里表達。且BBM1卵細胞表達胚珠中胚乳未發(fā)育，如圖9-b。
圖九 受精卵中BBM1的父系表達
a. 紅色箭頭指向受精卵核
b.黑色箭頭指向胚乳位置
實驗團隊敏銳地指出，BBM1有可能是啟動胚胎發(fā)育的“開關(guān)”。為了測試這個想法，他們用crisperkis9技術(shù)敲除了BBM1，BBM2，以及BBM3，果然水稻胚胎發(fā)育異常(如圖10-a)。而在這三重突變體里引入BBM1基因，胚胎發(fā)育過程又會被重新恢復（如圖10-b）。
圖十 bbm1 bbm2 bbm3突變胚胎的表型和
單倍體誘導
原來，原本雌配子中的bbm1是休眠的，當精子中的bbm1表達時，會激活雌配子中的bbm1，共同調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育。
圖十一 BBM1在水稻胚胎發(fā)生中的作用示意圖
也就是說在MiMe品系卵細胞中再異位表達BBM1，就可以誘導水稻孤雌生殖，團隊也對此做了驗證，成功培育出了健康穩(wěn)定的二倍體。由于在其他谷類作物中也發(fā)現(xiàn)了同源BBM樣和MiMe基因，因此本文所述的方法或許可擴展到大多數(shù)谷類作物。
圖十二 驗證實驗中MiMe + BBM1-ee品系的表征
這篇文章的作者之一Venkatesan Sundaresan曾說：“我們有一個雙倍體的卵細胞，它能形成胚胎，長成一個克隆體。”很好的概括了他們的成就。
06
Fix突變體途徑
讓我們驕傲的是， 2019年1月4日，Nature Biotechnology發(fā)表了來自中國農(nóng)科院王克劍課題組的題為“Clonal seeds from hybrid rice by simultaneous genome engineering of meiosis and fertilization genes”的研究論文，他們也發(fā)現(xiàn)了一種最終實現(xiàn)無融合生殖的機制。
該課題分為三個部分。首先是驗證mime的可行性。同樣通過CRISPR-Cas9 制備osMIME品系，圖1-b中的熒光染色體的兩個信號即表明MiMe確實減數(shù)異常分裂。但發(fā)現(xiàn)其后代倍性增加時，可育性大幅下降。
圖十三 探索MiMe技術(shù)在雜交水稻品種中
的可行性
第二步就是解決染色體逐代倍增的問題。有資料顯示MTL基因可以觸發(fā)單倍體誘導，該課題就試圖據(jù)此誘導mime形成單倍體。流式細胞術(shù)顯示，實驗制備的MTL突變體中，這些植物中有九個確實是單倍體，而兩個是二倍體，均為純和。而這兩個二倍體也可能是由于單倍體胚胎自發(fā)加倍而產(chǎn)生的。研究表明，雙倍單倍體植物顯示出正常的營養(yǎng)和穗生長。
圖十四 誘導單倍體的探索
第三步就是結(jié)合上述技術(shù)，完成無融合生殖的過程。圖十五-a左側(cè)表示同時使用了上述技術(shù)的異常減數(shù)分裂過程。先通過MiMe技術(shù)使雜交植株生成二倍體配子，又通過MTL基因編輯來使父本基因組消失。這和我們介紹的第一項研究異曲同工，似乎揭示著科學研究的環(huán)環(huán)相扣。
圖十五 Fix突變體實驗驗證
最終得到的Fix突變體既保持了雜交水稻品種的雜交優(yōu)勢，又避免了自我受精時的倍性增加，基本實現(xiàn)了無融合生殖。雖然實驗中，用于誘導父系基因組消除的MTL基因?qū)﹄s種生育力有負面影響，仍需探索提高Fix突變體生育力的方法，但已經(jīng)是非常激動人心的成就了。
07
“蒲公英”的思路
——PAR基因的發(fā)現(xiàn)
MiMe品系的路線告一段落
最后讓我們來看看最近新在蒲公英中發(fā)現(xiàn)的
一條路線
自然界中其實有很多能夠無融合生殖的植物，等著我們?nèi)グl(fā)掘其中的機制。蒲公英就是非常理想的無融合生殖研究材料。多倍體蒲公英能夠給二倍體有性植物體傳粉。例如其二倍體材料可以接收四倍體的花粉，形成符合無融合生殖特點的三倍體材料。
圖片十六 蒲公英的生殖特例
作者以三倍體無融合生殖材料A68為研究對象，通過伽馬射線照射了2650個單株，以尋找缺失無融合生殖LOP（LOSS OF PARTHENOGENESIS）表型的種子。他們發(fā)現(xiàn)野生型種子的頭部是黑色的，而LOP表型種子的頭部則不是黑色，前者的胚胎處于發(fā)育過程中而后者卵細胞發(fā)育停滯（如圖十七）。研究種根據(jù)這個區(qū)別尋找缺失無融合生殖LOP品系的種子。
圖十七 LOP品系的區(qū)別
接著，他們對LOP品系進行探究，利用BAC文庫和nanopore測序構(gòu)建了其PAR區(qū)段的完整圖譜，總共發(fā)現(xiàn)有3個單倍型，其中一個單倍型與其他兩個差異較大，是顯性無融合生殖單倍型。
圖十八 PAR位點和LD結(jié)構(gòu)特征分析
通過標記輔助選擇再次將區(qū)間縮小，并利用CRISPR–Cas9技術(shù)對該區(qū)間范圍內(nèi)的13個候選基因都進行基因敲除，發(fā)現(xiàn)只有一個基因A_g295的突變體與之前LOP的表型一致，并且A_g295基因的突變體不能進行孤雌生殖，只有授粉才能結(jié)實，因此認定A_g295基因就是控制孤雌生殖的PAR基因。
圖十九 通過CRISPR-Cas9誘變鑒定PAR基因
作者在山柳菊里也發(fā)現(xiàn)了類似基因，驗證實驗又證明該模型對生菜也適用。而生菜是菊科的重要蔬菜，包括葉用的生菜和莖用的萵筍，而雜交生菜過于昂貴，所以生菜一般是自交繁殖。因此，在生菜中引入無融合生殖，可以使有活力的雜交品種被開發(fā)和繁殖，具有極大的經(jīng)濟價值。
圖二十 山柳菊和生菜中的驗證
結(jié)語
隨著一代又一代育種專家們的努力，無融合生殖的研究已經(jīng)取得了重大的進展。當然，仍然有很多的謎團尚未破解，很多的問題沒有解決，比如無融合生殖對子代有哪些不良影響，如何提高子代的成活率與結(jié)實率，比如其它經(jīng)濟作物中是否還能找到新的無融合生殖途徑。
總之，想真正實現(xiàn)從“1”到“∞”多，我們還有很長的路要走。
參考文獻：
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[8]Underwood Charles J,Vijverberg Kitty,Rigola Diana,Okamoto Shunsuke,Oplaat Carla,Camp Rik H M Op den,Radoeva Tatyana,Schauer Stephen E,Fierens Joke,Jansen Kim,Mansveld Sandra,Busscher Marco,Xiong Wei,Datema Erwin,Nijbroek Koen,Blom EvertJan,Bicknell Ross,Catanach Andrew,Erasmuson Sylvia,Winefield Christopher,van Tunen Arjen J,Prins Marcel,Schranz M Eric,van Dijk Peter J. A PARTHENOGENESIS allele from apomictic dandelion can induce egg cell division without fertilization in lettuce.[J]. Nature genetics,2022,54(1).
文字/朱宛瑩 全組人員
圖片/網(wǎng)絡
編輯/張怡芊
