摘要
HBV RNA上存在m?A修飾位點，作者團隊的前期研究認為3.5kb HBV RNA上5’端的m?A修飾促進了其逆轉錄過程，而所有HBV RNA共有的3’端m?A修飾則降低了RNA的穩定性。該文發現HBV轉錄本的m?A修飾可以調節宿主對HBV感染后的固有免疫反應。研究發現，m?A的甲基轉移酶METTL3和METTL14低表達可致維甲酸誘導基因I (RIG-I)對病毒RNA的識別增加，從而刺激I型干擾素的產生。反過來，過表達METTL3和METTL14時則結果相反。病毒RNA的m?A修飾抑制了RIG-I信號通路，而病毒RNA的m?A位點突變后RIG-I信號通路被激活。m?A閱讀蛋白(YTHDF2和YTHDF3)可以通過與m?A修飾的RNA結合抑制RIG-I對病毒RNA的識別，從而抑制RIG-I信號通路的激活。該研究為帶有m?A修飾病毒RNA的免疫逃避機制提供了新的思路。
當病毒感染宿主細胞后，代表第一道防線的固有免疫反應會即刻被觸發。而病毒可通過抑制宿主的固有免疫反應來逃避宿主的免疫清除，以建立慢性感染。據文獻報道，在HBV感染過程中，HBV的前基因組RNA（pgRNA）可被宿主的模式識別受體RIG-I識別，激活免疫應答。然而，近期有研究發現，HBx蛋白可促進線粒體相關MAVS蛋白的泛素化降解從而破壞RIG-I/MAVS信號。因此，HBV與宿主固有免疫系統的相互作用復雜，病毒抑制宿主固有免疫的機制仍需進一步研究。
研究顯示，超過25%的哺乳動物轉錄本帶有m?A修飾，m?A甲基化是mRNA非常常見的修飾，并與包括固有免疫反應、干細胞分化、減數分裂過程、應激反應和癌癥等多種生物過程有關。mRNA的m?A修飾由METTL3、METTL14和WTAP組成的甲基轉移酶復合物添加而成，這種修飾通常富集在細胞mRNA的3’-UTR和終止密碼子附近。m?A修飾的mRNA被YTH（YT521-B同源域）家族蛋白(YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3)識別，以調控mRNA的穩定性、翻譯和定位。m?A去甲基酶FTO和ALKBH5能夠消除m?A甲基化,表明m?A修飾受甲基轉移酶和去甲基酶的共同調節。超HBV基因組全長的HBV pgRNA在其5’和3’端的莖環結構處各有一個m?A修飾位點，通過此前的研究，作者認為5’端的m?A修飾增加了pgRNA的逆轉錄效率，3’端的m?A修飾則降低了HBV RNA的穩定性。
在這項研究中，作者進一步探究了m?A修飾的HBV轉錄本在調節宿主固有免疫反應中發揮的作用，證明了YTHDF2識別病毒RNA上的m?A修飾，抑制了RIG-I信號通路的激活，進而抑制病毒感染后的固有免疫應答，為病毒的宿主免疫逃逸機制提供了新思路。
1、 m?A甲基轉移酶抑制固有免疫反應
作者在1.3× HBV質粒的基礎上構建了5’和3’端m?A修飾位點（A1907）的單突變和雙突變質粒（圖1A）。后續實驗發現，與野生型1.3× HBV質粒相比，轉染5’端A1907C突變的1.3× HBV質粒后細胞內的磷酸化IRF3水平上升（圖1B）。由于莖環結構中m?A位點的突變導致其莖環中的堿基對不匹配，因此A1907C突變可能會使莖環的二級結構發生畸變（圖1C），作者進一步構建了莖環對應位點U突變為G使莖環結構堿基匹配的質粒（CM），轉染后發現IRF3的磷酸化情況與5’ A1907C突變的質粒沒有統計學差異（圖1C&D），基本排除了5’端A1907C突變所致IRF3的磷酸化水平升高是由于莖環結構的變化所致的可能性。作者進而發現，在轉染了1.3× HBV的HepG2細胞中敲減METTL3/14也可使IRF3的磷酸化水平增加（圖1E），而過表達METTL3/14使IRF3的磷酸化水平降低（圖1F）。結合已有的有關RIG-I主要識別pgRNA的5’端以激活先天免疫應答的研究報道，提示pgRNA 5’端的m?A修飾可能影響RIG-I信號轉導。
圖 1 HBV pgRNA的m?A修飾影響IRF-3的激活
2、病毒RNA的m?A修飾調節RIG-I的識別
作者在RIG-I缺失的細胞中轉染野生型及5’端A1907C突變的1.3× HBV質粒，發現在缺乏RIG-I的情況下，HBV質粒轉染并不會誘導IRF3的磷酸化升高（圖2A），提示病毒RNA的m?A修飾可能是通過RIG-I信號通路來影響干擾素相關信號。由于RIG-I的沉默抑制了HBV誘導的IRF3磷酸化水平變化，作者進一步檢測了m?A修飾是否影響病毒RNA和RIG-I之間的相互作用。作者將flag標記的RIG-I蛋白分別與1907位點單突變或雙突變的1.3× HBV質粒共轉染，并使用抗flag抗體進行RNA免疫共沉淀。結果發現，5’端A1907C突變后RIG-I上富集的pgRNA水平增加（圖2D），提示5’端的m?A修飾在逃避RIG-I識別pgRNA的過程中起關鍵作用。
圖 2 pgRNA的m?A位點突變增加了RIG-I與pgRNA的相互作用
3、YTHDF2和YTHDF3蛋白影響RIG-I信號通路
已有研究報道YTHDF家族的蛋白屬于m?A 閱讀器蛋白，能夠識別并結合m?A修飾的RNA，調節其穩定性及翻譯。因此，作者進而研究了YTHDF家族蛋白是否通過與m?A修飾的病毒RNA相互作用影響HBV刺激后的RIG-I信號轉導通路。如圖3A、3B所示,過表達YTHDF2和YTHDF3使1.3× HBV質粒誘導的IRF3磷酸化水平降低，而在轉染5’端A1907C突變的1.3× HBV質粒后，YTDHF蛋白的上述作用消失。此外，在轉染1.3× HBV質粒細胞中，敲減YTHDF2和YTHDF3可以增加IRF3的磷酸化水平，而在轉染5’端A1907C突變的1.3× HBV質粒細胞中，敲減YTHDF2和YTHDF3不影響IRF3的磷酸化水平（圖3C&D）。以上結果提示YTHDF2和YTHDF3可通過與m?A修飾的HBV RNA相互作用來調節宿主免疫應答。
圖 3 YTHDF2和YTHDF3抑制由HBV刺激產生的IRF3介導的免疫應答。
4、病毒RNA的m?A修飾通過招募
m?A 閱讀器蛋白抑制RIG-I的識別
為了進一步驗證YTHDF2蛋白是否影響RIG-I對病毒RNA的識別，作者在細胞中敲減YTHDF2并過表達FLAG-RIG-I和1.3× HBV質粒。RNA免疫共沉淀實驗發現，敲減YTHDF2后RIG-I與HBV WT pgRNA的相互作用增加（圖4A）。然而敲減YTHDF2并不影響RIG-I與5’ m?A位點突變的HBV pgRNA的結合。以上結果說明，YTHDF2通過與m?A修飾的病毒RNA相互作用，抑制RIG-I對病毒RNA的識別，抑制RIG-I介導的宿主免疫應答。
圖 4 敲減YTHDF2后RIG-I對HBV pgRNA的識別增加。
總結
在該研究中,通過分別沉默甲基轉移酶(METTL3/14)和YTHDF蛋白，以及使用m?A缺陷突變體，揭示了HBV病毒RNA上m?A修飾對宿主抗病毒免疫反應的影響及機制。證明YTHDF蛋白是一種與m?A修飾的pgRNA結合的m?A閱讀器蛋白,可競爭性抑制RIG-I對病毒RNA的識別，抑制下游的IFN表達（圖5）。
圖 5 病毒RNA的m?A修飾可抑制宿主固有免疫反應。
Kim GW, Imam H, Khan M, Siddiqui A. N6-Methyladenosine modification of hepatitis B and C viral RNAs attenuates host innate immunity via RIG-I signaling. J Biol Chem. 2020;295(37):13123-13133. doi:10.1074/jbc.RA120.014260
