文章來源：中華內分泌代謝雜志, 2017,33(03): 236-241
作者：劉冰雯 向宇飛 周智廣
一、引言
巨噬細胞廣泛分布于人體多個組織器官，它能識別外來病原體，在固有免疫、炎癥反應中發揮重要作用。1993年Hotamisligil等發現肥胖動物模型脂肪組織的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)分泌增加，首次將肥胖與炎癥相聯系，直到2003年Xu等和Weisberg等發現肥胖動物模型的脂肪組織存在大量巨噬細胞浸潤，從此開啟了脂肪組織巨噬細胞(adipose tissue macrophages, ATM)與肥胖相關性的研究。大量研究提示巨噬細胞是脂肪組織最主要的炎癥細胞，在肥胖引起的胰島素抵抗中起到關鍵性作用。據統計，世界上肥胖人數超過10億，肥胖日益成為全球關注焦點，而肥胖發生過程中巨噬細胞的病理生理作用還未完全闡明。本文總結了近年來對ATM在肥胖中的免疫學致病機制的研究，并闡述ATM與胰島素抵抗之間的密切關系，旨在為肥胖的免疫學治療提供新靶點。
二、肥胖與ATM浸潤
肥胖患者或動物模型的白色脂肪組織中存在巨噬細胞浸潤。Xu等[3]首先發現ob/ob小鼠、db/db小鼠或高脂飲食誘導(high fat diet，HFD)肥胖小鼠白色脂肪組織的巨噬細胞相關基因表達水平升高，脂肪組織免疫組化進一步提示F4/80＋細胞(小鼠巨噬細胞標記物)占脂肪組織的比例明顯升高(肥胖小鼠ATM和正常對照小鼠的比例分別為41%±4%與12%±2%, P<0.005)，并與脂肪細胞平均橫截面積正相關[4]。本研究組亦發現高脂飲食小鼠附睪旁脂肪的巨噬細胞比例升高，且巨噬細胞比例隨高脂飲食的時間延長而增加[6]。肥胖患者多個部位的脂肪組織也發現該現象，且內臟脂肪比皮下脂肪組織中的巨噬細胞浸潤更為嚴重，前者與體重指數或腰圍的相關性顯著高于后者，提示內臟脂肪和肥胖的關系更為密切[7]。
三、ATM增加的途徑
正常小鼠和人的脂肪組織中的巨噬細胞稱為組織固有巨噬細胞(resident macrophage)，為分散于脂肪組織的小圓形細胞，參與維持脂肪組織的穩態[1,4]。肥胖發生時，ATM的數量劇增[4]。了解ATM的來源對以ATM為靶向的藥物研發至關重要。根據近年研究，ATM增加的途徑如下。
1．ATM的募集：
急性感染的組織同樣存在巨噬細胞浸潤，一般認為炎癥發生時，粒細胞集落刺激因子和趨化因子刺激骨髓緊急造血，釋放大量中性粒細胞和單核細胞入外周循環，組織局部的趨化因子吸引外周循環中經典的Ly6Chi單核細胞穿過血管內皮，遷入組織，分化為巨噬細胞和樹突狀細胞，造成局部巨噬細胞浸潤，該過程稱為巨噬細胞的募集[1]。
肥胖時ATM浸潤的機制與之類似。肥胖動物模型和患者存在骨髓增生和外周單核細胞增加。有研究發現ob/ob小鼠骨髓造血細胞明顯增生，伴外周單核細胞數升高，肥胖患者也發現類似現象，而減重手術能降低患者外周單核細胞的數量和百分比，這提示脂肪組織可能可進一步影響骨髓及外周單核細胞數量[8,9]。此外，小鼠異體骨髓移植實驗證明肥胖小鼠85%的ATM來源于骨髓[4]。Oh等[10]將標記PHK26熒光染料的單核細胞注入肥胖小鼠外周循環后，肥胖小鼠脂肪組織內出現PHK26＋細胞，且其比例高于對照組，進一步證實ATM由外周循環遷入組織。ATM數量受趨化因子的影響，多個研究發現肥胖患者和小鼠脂肪組織的趨化因子增加。趨化因子對脂肪細胞募集巨噬細胞有關鍵作用。多數學者認為脂肪組織趨化因子增加是ATM浸潤的始發事件之一，營養過剩導致脂肪細胞增生和過度膨脹，造成局部缺氧和內質網應激，刺激脂肪細胞分泌趨化因子，募集單核細胞至脂肪組織，導致巨噬細胞浸潤。聚集的ATM本身也表達趨化因子，形成惡性循環[11]。下面將重點論述幾種趨化因子。
單核細胞趨化因子(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)及其受體CCR2(CC chemokine receptor 2)是研究最多的趨化因子及受體。本研究組實驗發現肥胖小鼠附睪脂肪組織MCP-1的表達較正常組上調約7倍，肥胖患者也發現類似現象[7,12]?；蚯贸蜻^表達實驗提示MCP-1和CCR2顯著影響ATM的浸潤和胰島素抵抗[13,14]。動物實驗發現肥胖小鼠脂肪組織的趨化因子CXC受體3(chemokine C-X-C motif receptor 3, CXCR3)、趨化因子CXC受體12(chemokine C-X-C motif ligand 12, CXCL12)、CC趨化因子受體5(CC chemokine receptor 5, CCR5)基因表達水平上調，敲除CXCR3、CCR5或阻斷CXCL12配體趨化因子CXC受體4(C-X-C motif chemokine receptor 4, CXCR4)肥胖小鼠的ATM含量均明顯下降，伴糖耐量或胰島素敏感恢復，提示多個趨化因子參與ATM浸潤[15,16,17]。
趨化能力并非僅限于趨化因子及趨化因子受體系統，有研究發現class 3 semaphorin E (Sema 3E)和其受體plexin D1也對ATM募集起重要作用，它是一種胚胎神經和心血管系統發育的神經導向分子，在HFD肥胖小鼠的脂肪組織Sema3E-plexinD1通路表達上調[18]。
以上種種證據均提示，骨髓來源的單核細胞在趨化因子的作用下遷入脂肪組織，造成ATM浸潤。除了影響脂肪組織局部趨化因子的大量表達外，聚集的ATM本身也足以進一步誘導骨髓增生[8]。有研究報道將肥胖小鼠的內臟脂肪移植到正常小鼠可誘導后者出現單核細胞增多癥。研究發現ATM表達的S100A8/A9蛋白可能參與該過程，該蛋白可激活Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)-髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)信號通路和NOD樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-leucine-rich repeats containing pyrin domain 3, NLRP3)炎性體，從而促進ATM分泌白細胞介素(IL)-1β至外周循環，刺激骨髓增生，造成惡性循環[8]。
2．ATM的增殖：
Amano等[19]給ob/ob小鼠注射氯膦酸二鈉脂質體，以消除80%以上的外周單核細胞，卻發現ATM數量并未下降，說明ATM的數量維持并不僅依賴于外周單核細胞。肥胖患者和動物模型也存在ATM增殖活躍。Ki67是一種在細胞周期活躍時表達的蛋白，ob/ob小鼠內臟脂肪組織Ki67＋巨噬細胞的比例比對照組高4倍，肥胖患者皮下脂肪組織的Ki67的基因表達約為正常對照組的2.5倍，并主要圍繞在壞死的脂肪組織周圍[19,20]。外周單核細胞的募集可能在肥胖初期、巨噬細胞數量劇增時起主要作用，當募集外周單核細胞不足以滿足局部ATM數量時，原位增殖是維持ATM數量的重要方式。
3．ATM的蓄積：
生理情況下，隨著急性炎癥的消退，巨噬細胞逐漸從炎癥組織遷移至外周淋巴結，長期慢性炎癥可能與巨噬細胞遷出能力受損有關。研究者首先在動脈粥樣硬化中發現，巨噬細胞蓄積是斑塊慢性炎癥的重要機制，低氧環境能誘導人和小鼠動脈粥樣硬化斑塊的泡沫細胞表達Nertin-1及其受體Unc5b，這種神經導向分子能阻斷趨化因子對巨噬細胞的定向遷移，導致泡沫細胞在動脈壁內蓄積[21]。與動脈粥樣硬化類似，肥胖者的脂肪組織也存在低氧和巨噬細胞浸潤，肥胖患者和小鼠ATM亦高表達Nertin-1和其受體Unc5b，基因敲除Nertin-1的肥胖小鼠的ATM數量比對照組低50%，而外周淋巴結的巨噬細胞數量高于對照組[22]。提示Nertin-1參與的巨噬細胞蓄積是ATM長期浸潤的機制之一，恢復巨噬細胞的定向遷出是改善胰島素敏感性的潛在治療靶點之一。
四、ATM的極化
巨噬細胞在不同的微環境中呈現較大可變性，一般將巨噬細胞分為經典活化型(又稱M1型)和替代活化型(又稱M2型)。這種命名衍生于Th1和Th2型免疫反應，Th1型免疫反應的干擾素γ(interferon gamma, IFN-γ)等細胞因子可刺激巨噬細胞向M1型活化，而Th2型免疫反應的IL-4和IL-13激活信號轉導子和轉錄激活子6(singnal transducers and activators of transcription 6, STAT6)以誘導M2型活化[23]。M1型和M2型均表達F4/80、CD68和CD11b，但M1型巨噬細胞為CD11c＋而M2型巨噬細胞CD11c－。常見的M1型巨噬細胞表達基因有一氧化氮合酶2(nitric oxide synthase 2, Nos2)等，而M2型巨噬細胞表達精氨酸酶1(arginase-1, Arg1)、幾丁質酶3蛋白3(chitinase 3-like 3, Ym1)、CD301等[1,23]。目前并沒有一種表面標記物能夠確切區分人類的M1型和M2型巨噬細胞，準確的區分需要多種細胞標志物的組合。除了細胞標志物和表達基因的差異外，M1和M2型巨噬細胞的生物學特性也不同，M1型巨噬細胞通過分泌IL-6、TNF-α等促炎因子參與消除病原體，M2型巨噬細胞通過分泌IL-10和生長因子起抑制炎癥、組織修復和維持脂肪組織生理功能等作用[1]。
肥胖時ATM向M1型巨噬細胞極化。多個研究發現正常小鼠的ATM以CD11c－巨噬細胞為主，CD11c＋巨噬細胞僅占ATM的9.3%，當肥胖發生時，每單位質量脂肪組織的CD11c＋巨噬細胞數量增加5.5～20倍，而CD11c－巨噬細胞無明顯差別[24,25]。ATM基因表達提示，CD11c＋巨噬細胞類似M1型，其炎性基因的增加表達(如誘導型一氧化氮合酶、IL-6、TLR4)，而CD11c－巨噬細胞表達Ym1，表型類似M2型巨噬細胞[24,25]。劇增的CD11c＋巨噬細胞主要由外周單核細胞募集而來，聚集在壞死的脂肪細胞周圍，部分形成多核巨細胞，細胞質內有吞噬的脂滴，它與壞死的脂肪組織一起形成冠狀結構(crown-like structures)，而CD11c－巨噬細胞為脂肪組織的組織固有細胞，分散于組織間隙[25,26]。
目前多數文獻仍采用M1、M2型的二分類法歸納ATM特性。但實際上體內的ATM呈現出復雜、獨特的連續表型譜。Kratz等[27]發現肥胖患者ATM并不表達人慢性感染性炎癥中經典活化的M1型巨噬細胞的標記物。高糖、高脂、高胰島素環境誘導活化的巨噬細胞和病原體刺激活化的巨噬細胞的基因表達并不相同，比如前者比后者表達更高水平的三磷酸腺苷結合盒轉運體A1(ATP binding cassette transporter A1, ABCA1)和更低的CD206。以上研究提示，不能簡單地將代謝異常環境中活化的CD11c＋巨噬細胞等同于感染性炎癥激活的M1型巨噬細胞，它們可能存在不同的活化機制。關于肥胖發展過程中巨噬細胞表型變化和對應的功能還有待研究，目前對人類巨噬細胞譜缺乏統一的標記物，也尚不明確巨噬細胞標記物的表達所涉及的細胞信號通路，這限制了研究的開展。
五、ATM與胰島素抵抗的關系
ATM是脂肪組織最主要的炎癥細胞，近來許多研究通過基因敲除技術建立動物模型，探索ATM和胰島素抵抗的因果關系以及影響ATM活化狀態的細胞因子。
1．M1型巨噬細胞介導胰島素抵抗：
研究發現，M1型巨噬細胞加重胰島素抵抗，利用基因敲除HFD小鼠CD11c＋ATM即出現脂肪組織炎癥減輕和胰島素抵抗的改善[28]?；蚯贸鼵cr2的HFD小鼠的CD11c＋ATM數量明顯下降，伴隨脂肪組織炎癥基因表達下降和胰島素抵抗的改善[13]，可見脂肪組織的CD11c＋ATM浸潤是胰島素抵抗的原因之一。
M1型巨噬細胞參與胰島素抵抗的機制與升高的游離脂肪酸(free fat acids, FFAs)有關，FFAs可能是ATM加重胰島素抵抗的始發因素。Fetuin-A是一種肝臟分泌的糖蛋白，肥胖時其血漿濃度升高[29]。在Fetuin-A介導下，FFAs能間接地激活CD11c＋ATM的TLR4，使TLR4下游的核因子-κB抑制蛋白激酶β/核因子-κB(IKKβ/NF-κB)和c-Jun氨基末端激酶-活化蛋白1(c-Jun N-terminal kinase/activator protein 1, JNK/AP-1)炎癥信號通路磷酸化，導致細胞的炎癥基因表達增加，并分泌更多的TNF-α、IL-6、MCP-1等炎癥因子，也有研究發現FFAs亦激活ATM的TLR2參與胰島素抵抗[24]。生理情況下，胰島素通過胰島素受體介導使胰島素受體底物(insulin receptor substrate, IRS)的酪氨酸磷酸化，從而激活下游的磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(phosphoinositide 3-kinase/AKT serine/threonine kinase, PI3K/Akt )信號通路，促進細胞對葡萄糖的攝取，發揮胰島素的降糖作用。但活化的IKKβ和JNK能使IRS的絲氨酸磷酸化，阻斷IRS的酪氨酸磷酸化和下游的PI3K/Akt通路，導致胰島素抵抗[30]。另外，巨噬細胞分泌的炎癥因子，如TNF-α，能進一步激活IKKβ/NF-kB、JNK/AP-1、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)等炎癥通路，形成惡性循環[31]。
飽和脂肪酸也參與胰島素抵抗，肥胖時過量的飽和脂肪酸能抑制巨噬細胞表達CGI-58(comparative gene identification-58)，該蛋白具有調控線粒體功能的作用[32]。動物實驗發現，敲除肥胖小鼠巨噬細胞的CGI-58基因后，ATM出現線粒體功能失調和活性氧簇介導的氧化應激，導致NLRP3炎性體和下游的caspase-1的活化，伴胰島素抵抗和高血糖的加重[32]。NLRP3炎性體是一種細胞胞質內的蛋白復合物，為Nod樣受體(the Nod like receptor, NLRs)家族中的一員，在肥胖糖尿病患者脂肪組織的表達增加[33]?；罨腘LRP3炎性體和下游的caspase-1并不影響脂肪組織M1/M2的比例，但能促進IL-1β和IL-18分泌，導致胰島素抵抗[33]。
2．M2型巨噬細胞能改善胰島素敏感性：
與M1型相反，脂肪組織M2型巨噬細胞分泌抗炎因子IL-10能抑制炎癥和改善胰島素抵抗[34]，因此M2型巨噬細胞的活化因子也間接影響胰島素敏感性。比如過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ)是一種脂肪酸的感受器，在脂肪組織M2型巨噬細胞中廣泛表達。只有在其作用下，IL-4才能激活STAT6，誘導髓系細胞的線粒體生物合成和脂肪酸氧化，PPAR-γ介導單核細胞向M2型巨噬細胞活化[35,36]?；蚯贸逝中∈缶奘杉毎鸓PAR-γ后，其脂肪組織M2型巨噬細胞的相關基因表達水平降低70%～80%，而M1型巨噬細胞的炎癥基因表達升高，伴胰島素抵抗和高血糖的加重[35]，提示PPAR-γ對M2型巨噬細胞表型的維持和恢復胰島素敏感性有重要作用。另一種與M2型巨噬細胞表型密切相關的細胞因子是Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor 4, KLF4)，它是轉錄因子鋅指結構的一種亞型。與PPAR-γ類似，KLF4能協同IL-4激活STAT6，抑制NF-kB信號通路，同時具有活化M2型巨噬細胞和抑制M1型巨噬細胞的作用[37]。敲除肥胖小鼠巨噬細胞的KLF4將導致肥胖小鼠脂肪組織的M2型巨噬細胞比例下降和胰島素抵抗、高血糖的惡化[37]。與正常人相比，肥胖患者皮下脂肪組織的KLF4表達水平下降了50%，這可能是脂肪組織內M1/M2比例升高的原因之一[37]。
3．ATM與體重改變：
有研究利用活體多光子顯微成像技術動態觀察高脂高糖喂養的小鼠ATM的遷移，發現CD11c＋ATM浸潤和遷移速度增加為肥胖初期事件，早于HFD小鼠體重改變[38]。前文已述，去除肥胖小鼠M1型巨噬細胞能恢復其胰島素敏感性，但與對照組相比，其體重并無統計學差異[28]，提示M1型巨噬細胞不依賴于體重介導胰島素抵抗。大部分研究亦提示脂肪組織M1型巨噬細胞的數量改變不伴隨體重變化，比如MCP-1過表達的HFD小鼠脂肪組織M1型巨噬細胞顯著增加伴胰島素抵抗，反之，敲除MCP-1的HFD小鼠M1型巨噬細胞數量下降伴胰島素敏感性恢復，但這兩種基因型小鼠的攝食量和體重均較野生型HFD小鼠無異，與之類似的肥胖小鼠模型還包括CXCR3－/－小鼠、CCR5－/－小鼠、Sema3eKo小鼠等[14,15,17,18]。有研究報道CCR2－/－HFD小鼠(M1型巨噬細胞顯著降低)體重較野生型HFD小鼠下降15%，可能是與該模型小鼠的攝食下降有關，與體重匹配的對照組相比，CCR2－/－HFD小鼠的胰島素抵抗仍明顯改善[13]。這提示肥胖時M1型巨噬細胞的浸潤不影響或僅輕微影響體重。然而M2型巨噬細胞與M1不同，Mac-PPARγKO的HFD小鼠(巨噬細胞特異性敲除PPARγ)或MyeKO的HFD小鼠(髓系細胞特異性敲除KLF4)脂肪組織M2型巨噬細胞數量顯著下降，伴隨更嚴重的胰島素抵抗和體重、脂肪總量的增加，基因表達提示β氧化相關基因表達下降，提示M2型巨噬細胞可能參與脂肪酸氧化，具有減重作用，增加M2型巨噬細胞比例為治療肥胖的潛在靶點[35,37]。
六、M2型巨噬細胞介導白色脂肪棕色化
除了分泌抗炎因子IL-10，脂肪組織的M2型巨噬細胞還對白色脂肪棕色化起關鍵作用。棕色脂肪主要分布于嚙齒類動物和嬰兒，特征性地通過解耦聯蛋白1(uncoupling protein 1, UCP-1)介導產熱。在長期寒冷或β腎上腺素受體激活物刺激下，白色脂肪組織也可以出現高表達UCP-1的細胞，與棕色脂肪細胞相似卻不同，稱為米色脂肪，該過程稱為白色脂肪棕色化[39]。棕色脂肪和米色脂肪參與適應性產熱，具有減重和改善胰島素抵抗的作用，是近年肥胖治療的研究熱點。M2型巨噬細胞對寒冷誘導米色脂肪起重要作用，低溫環境中小鼠白色脂肪的M2型巨噬細胞增加，而M1型比例不變[39,40]。這些增加的M2型巨噬細胞可能由外周CCR2＋單核細胞招募至脂肪組織，在嗜酸性粒細胞分泌的IL-4、IL-13(Th2型免疫反應細胞因子)作用下向M2型巨噬細胞活化[41]。小鼠受冷刺激時，M2型巨噬細胞分泌大量去甲腎上腺素(約占總量50%以上)，誘導白色脂肪棕色化，促進脂解，增加產熱[40]。IL-4/13－/－小鼠的米色脂肪生成受到抑制，而為處于常溫中(30℃)的小鼠注射IL-4能增加皮下脂肪組織的M2型巨噬細胞和UCP-1基因表達，提高小鼠在冷環境中的總產熱能[41]。
van Marken等[42]發現，不同的室溫下，年輕肥胖患者的棕色脂肪活性低于體重正?；颊撸崾痉逝只颊叩淖厣竞驼T導米色脂肪的能力受損。動物實驗也發現HFD小鼠皮下脂肪組織的UCP-1蛋白和合成兒茶酚胺的相關酶基因表達顯著降低[41]。與之類似，注射TNF-ɑ的正常小鼠的脂肪組織UCP-1基因表達也受抑制，而用氯膦酸二鈉脂質體消除HFD小鼠脂肪組織的M1型巨噬細胞可恢復UCP-1的基因表達[43]，提示肥胖時局部炎癥反應和ATM向M1型極化可能是棕色和米色脂肪組織受抑制的原因之一。
M2型巨噬細胞對誘導白色脂肪棕色化至關重要，為潛在治療靶點，目前已在肥胖動物模型上開展相關研究。前文提及Th2型細胞因子如IL-4能作用于巨噬細胞內的IL-4Rɑ，使單核細胞向M2型活化[41]。有研究者將目光投向Th2型細胞因子，為肥胖小鼠模型注射IL-4能提高HFD小鼠脂肪組織的產熱基因表達(包括UCP-1)，小鼠血糖和胰島素敏感性也相應改善[41]。也有研究直接關注于M2型巨噬細胞，受體相互作用蛋白140(receptor interacting protein 140, RIP140)是一種NF-kB信號通路的協同刺激因子，能促進M1型巨噬細胞活化和炎癥，基因敲除巨噬細胞RIP140能使肥胖小鼠脂肪組織M2型巨噬細胞比例增加約3倍，伴白色脂肪棕色化和胰島素敏感性恢復，將該種小鼠模型的ATM(以M2型巨噬細胞為主)注入野生型肥胖小鼠脂肪組織，亦能誘導后者的米色脂肪生成，并減輕胰島素抵抗[44]。M2型巨噬細胞對米色脂肪的誘導分化對治療肥胖極具前景。
七、總結與展望
綜上所述，營養過剩導致脂肪組織趨化因子分泌增加，募集骨髓來源的外周單核細胞進入脂肪組織并主要分化為M1型巨噬細胞，巨噬細胞原位增殖和遷出能力受損加重了ATM浸潤。促炎的M1型巨噬細胞分泌大量炎性細胞因子，激活炎癥通路，參與肥胖患者的胰島素抵抗(圖1)。脂肪組織的炎癥也牽涉到其他固有免疫和適應性免疫細胞，本文不展開討論。
圖1 肥胖時脂肪組織巨噬細胞的變化
充分了解肥胖中ATM的病理生理可為肥胖的免疫治療提供有效的新靶點，有趣的是Asterholm等發現脂肪組織局部炎癥信號通路缺陷的小鼠(TLR4信號通路缺陷、NF-κB信號通路缺陷或多種炎性信號通路同時缺陷)在予以高脂飲食負荷后，其血糖和胰島素敏感性卻比對照組更差。這似乎與之前炎癥導致胰島素抵抗的觀點相悖，之前研究發現敲除肥胖小鼠的TNF-α能改善其胰島素抵抗?？赡艿慕忉屖蔷植垦装Y是肥胖情況下機體代償的結果，它可能參與肥胖早期脂肪細胞的代償性增殖和重塑，炎癥信號通路缺陷導致多余的能量不能代償性地儲存于脂肪組織，過多的脂肪只能沉積于其他組織，加重脂肪肝和代謝異常。先前研究的TNF-α－/－HFD小鼠為全身系統性敲除TNF-α，而Asterholm實驗中的模型僅為脂肪組織局部的炎癥缺陷，這可能是兩種研究結果相悖的原因。提示需要重新思考以ATM在胰島素的抵抗的角色，肥胖時脂肪組織局部炎癥和多系統炎癥的關系也有待深入理解和探究。適度地調節免疫可能比單純盲目地以抑制炎癥能帶來更多益處。
