帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是當前世界范圍內最常見的神經退行性疾病之一[1]，其主要病理特征為中腦黑質-紋狀體通路出現多巴胺（dopamine，DA）能神經元的進行性退化。PD患者會出現靜止性震顫、運動遲緩等運動癥狀[2]，以及睡眠障礙、胃腸道功能障礙等非運動癥狀[3]。有30%的PD患者在運動功能障礙和中樞神經系統（central nervous system，CNS）疾病出現前就出現腸道神經系統（enteric nervous system，ENS）失調。在近些年的研究中，不斷有證據為“PD可能是腸源性疾病”這一假說提供支持[4]。
中醫“脾胃學說”與腦有著密切的聯系，脾胃為氣血生化之源，能升清降濁以營養全身，若其代謝失常，則腦神失養，導致眾多腦病[5]。甘松為敗醬科植物甘松Nardostachys jatamansi DC.的干燥根及根莖，是我國傳統中藥材，收錄于《中國藥典》2020年版一部[6]，入脾、胃經，有“醒脾”“行氣”“健胃”等功效。馬云枝教授認為脾虛濕阻、痰瘀互結是PD發生的主要病機，甘松既有“醒脾”之功，便有其統攝之效[7]。臨床上常使用甘松與石菖蒲配伍治療脾虛痰盛型原發性癲癇[8]。
傳統觀點認為PD與“肝風”相關[5]，PD患者久病則郁，有因病致郁，或因病使郁加重，甘松既有“行氣”之功，便有其治療之效。中醫理論中，胃與腦通過經氣直接相連，胃氣的變動可以直接影響到腦的功能[9]，甘松既有“健胃”之功，便有其滋養之效。臨床歸納甘松廣泛應用于疏解久病之郁，調理脾胃之氣，芳香避穢醒腦[10]。此外，現代藥理學研究表明，甘松對各種神經、精神疾病有較好的神經保護作用[11]，包括抗PD[12]和阿爾茲海默[13]等神經退行性疾病、抗抑郁[14]和鎮靜[15]等。
課題組前期研究發現甘松80%乙醇提取物可以調節PD大鼠腸道菌群，從而干預PD相關病理癥狀[16]，但尚缺乏基于中醫基礎理論探討甘松抗PD機制的研究。因此，本研究擬采用魚藤酮致大鼠PD模型，通過曠場實驗、斜板實驗以及大鼠紋狀體DA含量考察不同劑量甘松80%乙醇提取物對PD大鼠運動障礙的改善能力，篩選甘松抗PD最優劑量；在“腸-腦軸”理論的指導下，采用Western blotting和ELISA實驗檢測PD大鼠結腸和紋狀體中神經遞質的含量、腸道膠質細胞標志物和神經膠質細胞標志物的表達情況，探究甘松抗PD的作用機制，為將“脾胃學說”和“腸-腦軸”理論相結合治療PD的研究奠定基礎。
如表2所示，與對照組比較，模型組大鼠曠場總運動距離顯著縮短（P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組大鼠曠場總運動距離均顯著增加（P＜0.05、0.01、0.001），其中甘松中劑量組最佳，表明甘松中劑量組對PD大鼠自主活動能力的改善最為顯著。
如表3所示，與對照組比較，模型組大鼠上肢力量不足、停留角度顯著降低（P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組大鼠上肢協調能力顯著改善，斜板停留角度顯著升高（P＜0.01、0.001），其中甘松中劑量組最佳，表明甘松中劑量組對PD大鼠運動協調能力的改善最為顯著。
如表4所示，與對照組比較，模型組大鼠紋狀體中DA含量顯著降低（P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組大鼠紋狀體DA含量顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001），其中甘松中劑量組作用最佳。
如圖1、表5所示，模型組大鼠中腦黑質區域TH陽性神經元表達明顯下降（P＜0.05），胞體輪廓不清晰且胞體顯著縮小；經左旋多巴給藥后，PD大鼠TH陽性表達明顯升高（P＜0.05），胞體縮小較少；經甘松給藥后，PD大鼠TH陽性表達顯著升高（P＜0.01），表明甘松可有效抑制PD大鼠黑質TH陽性神經元的減少。
如表6所示，與對照組比較，模型組大鼠結腸中神經遞質DA、DOPAC、HVA、5-HT和5-HIAA含量顯著降低（P＜0.01、0.001），DA代謝速率（DOPAC＋HVA）/DA顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，左旋多巴組DA、DOPAC和HVA含量均顯著升高（P＜0.05），甘松組DA、DOPAC、HVA、5-HT和5-HIAA含量顯著升高（P＜0.01、0.001），DA代謝速率顯著降低（P＜0.05）。
如表7所示，與對照組比較，模型組大鼠紋狀體中DA、DOPAC、HVA、5-HT和5-HIAA含量顯著降低（P＜0.01、0.001），DA代謝速率（DOPAC＋HVA）/DA顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，左旋多巴組DA、HVA含量顯著升高（P＜0.01），DA代謝速率降低；甘松組DA、DOPAC、HVA、5-HT和5-HIAA含量顯著升高（P＜0.05），DA代謝速率降低，表明甘松能起到抑制PD大鼠DA、5-HT神經遞質含量下降的作用，并降低DA代謝速率。
如圖2、表8所示，與對照組比較，模型組大鼠結腸組織Iba-1、GFAP蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組結腸組織Iba-1、GFAP蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.001），表明腸神經膠質細胞的過度激活得到了有效抑制。
如圖3、表9所示，與對照組比較，模型組大鼠紋狀體中神經膠質細胞的標志物Iba-1、GFAP的表達水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，左旋多巴和甘松醇提物可顯著降低Iba-1、GFAP的表達（P＜0.001），表明甘松能夠有效抑制神經膠質細胞的過度激活。
本研究考察了甘松80%乙醇提取物低、中、高劑量對魚藤酮致PD大鼠運動功能障礙的改善作用和對PD大鼠紋狀體DA含量的影響，結果表明甘松中劑量組對PD大鼠運動功能障礙的改善作用最佳，選擇甘松中劑量進一步探究其抗PD機制。考察甘松對PD大鼠腸道膠質細胞、神經膠質細胞以及結腸和紋狀體中神經遞質的表達及含量的影響，結果表明甘松能夠抑制PD大鼠腸道膠質細胞及神經膠質細胞的激活；抑制PD大鼠結腸和紋狀體中DA、5-HT神經遞質及其代謝產物含量下降的趨勢，降低DA代謝速率。
綜上所述，甘松抗PD的機制與抑制腸道膠質細胞和神經膠質細胞的激活，抑制腸道DA的分解，升高紋狀體中DA及5-HT的含量有關，機制分析見圖4，驗證了甘松基于“脾胃學說”和“腸-腦軸”理論治療PD的可行性。
PD是以大腦中樞神經系統內DA能神經元的凋亡及α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-syn）的異常聚集為病理特征的神經系統退行性疾病，該病的患者會日漸產生嚴重的運動障礙[21]，另外有流行病學結果顯示其患者在早期通常有明顯胃腸道障礙[22]。2003年，Braak提出α-syn可能首先出現于腸道，隨后以朊病毒的方式由腸自腦傳播[23-24]，自此PD領域開展了對于“腸道起源”理論和微生物-腸-腦軸機制的研究。從改善胃腸道功能角度入手探索治療PD也逐漸成為研究熱點，腸和腦之間的雙向信息交流也越來越受到關注。
甘松是我國傳統中藥材，中醫理論認為其入脾、胃經，有“理氣”“醒脾胃”之功。本課題組前期研究結果證明[16]，甘松不僅能抑制神經元退化，治療PD，還能夠恢復紊亂的腸道微生物群，減輕腸道炎癥和神經炎癥。因此本研究立足于中醫“脾胃學說”，探討甘松治療PD，不僅符合傳統中醫藥理論，也具有現代藥理研究基礎。
CNS中的神經膠質細胞包括星形膠質細胞、少突膠質細胞和小膠質細胞[25]。神經膠質細胞被過度激活會導致的CNS神經炎癥，其發展進程主要受小膠質細胞影響，在某些情況下也會受星形膠質細胞和少突膠質細胞等大膠質細胞影響[26]。神經炎癥在PD的病理發展過程中起到了極為關鍵的作用[27]，研究表明，CNS的神經炎癥會促進DA能神經元細胞的凋亡和細胞自噬[28]。
小膠質細胞是CNS的常駐免疫細胞[29]，Iba-1是小膠質細胞的標志物。小膠質細胞能夠介導及調節潛在有害的神經炎癥反應[30]，發揮神經保護的作用[31]。研究發現，PD病人黑質中存在活化的小膠質細胞[32]。Sabogal-Guáqueta等[33]及Sironi等[34]發現，錯誤折疊的α-syn會激活中腦黑質致密部的小膠質細胞，使其分泌促炎因子，產生炎癥和氧化應激。星形膠質細胞能夠參與PD的神經病理過程[35-36]，星形膠質細胞標志物GFAP的表達增加是其被過度激活的標志[37]。星形膠質細胞過度激活后會產生極強的神經毒性，對突觸的功能和CNS的可塑性造成損傷，破壞腦環境穩態[38]，進一步加重神經炎癥和血腦屏障功能障礙，造成惡性循環狀態。
綜上所述，錯誤折疊的α-syn會引發CNS神經膠質細胞的過度激活，小膠質細胞分泌促炎因子的表達上升，導致神經炎癥加重；過度激活的星形膠質細胞破壞腦環境穩態，進一步加重CNS神經炎癥，進而引起DA能神經元的退化，在一定程度上加速PD的發生與發展過程。本研究結果表明，PD大鼠的紋狀體中，出現了GFAP和Iba-1表達上升的現象，這種現象可能是由于星形膠質細胞和小膠質細胞被過度激活引起的[39]。而甘松給藥后，抑制了神經膠質細胞的過度激活，制止了神經炎癥的加重，從而發揮了抗PD作用。
ENS通過交感神經中的迷走神經與CNS相連[40]，當ENS發生長期慢性炎癥會導致血腦屏障受損，最終引起CNS中神經炎癥的發生[41]。腸神經膠質細胞可能在PD患者產生的腸道炎癥和神經炎癥的發生和發展中起到重要作用[42]。GFAP是神經膠質細胞中星形膠質細胞的標志物，同時也是腸神經膠質細胞的一種廣為人知的標志物[39]，Devos等[43]首先證明在PD病人的結腸活檢中GFAP的表達水平有所提高，隨后Clairembault等[44]的研究也發現GFAP在PD病人的胃腸道表達上升，這可能是由于腸神經膠質細胞被過度激活引起的[45]。此外有研究表明，腸道微生物群的存在對以Iba-1為標志物的小膠質細胞的發育成熟和功能發揮至關重要[46]。
腸神經膠質細胞和神經膠質細胞分別在啟動腸道和大腦的先天免疫方面起著重要作用，與神經膠質細胞被過度激活后促進神經炎癥的歷程相同，腸神經膠質細胞被過度激活也可能會導致腸道炎癥[47]。在PD患者的結腸中發現了出現功能障礙的腸神經膠質細胞和路易小體[48]，證明了當ENS中出現α-syn的異常集聚后，腸神經膠質細胞的表達隨之上調[49]，進而可能會導致腸道神經元活性的改變以及腸道炎癥的發生。
本研究結果表明，PD大鼠的結腸中，也出現了GFAP和Iba-1表達上升的現象，這可能是由于腸神經膠質細胞被過度激活引起的[39]。結合本課題組前期研究結果發現[16]，PD大鼠出現腸道微生物紊亂和腸道α-syn的錯誤折疊，使腸神經膠質細胞被過度激活，分泌促炎因子，導致腸道炎癥的發生，α-syn隨迷走神經擴散至腦，進一步激活神經膠質細胞導致CNS神經炎癥，在PD中形成惡性循環[50]。甘松可以同時抑制腸道膠質細胞和神經膠質細胞的過度激活，制止這種惡性循環，起到抗PD的作用。
腦和腸道關系密切，二者均起源于早期胚胎的神經嵴[51]，腸-腦軸作為雙向交流系統，使得神經遞質對PD病人的非運動癥狀有著重要影響[52]。其中DA和5-HT及其代謝產物HVA、DOPAC、5-HIAA含量的變化是PD臨床診斷的主要指標之一[53]。
DA是負責調節平衡和運動的重要神經遞質[54]，PD發生后紋狀體中DA的進行性下降是引起運動癥狀的主要原因，DA信號通路被認為與PD機制相關或可用于相關治療。研究表明，PD患者結腸平滑肌層的DA含量低于正常人[55]，這表明腸多巴胺能系統的損害是導致PD病人出現胃腸道功能失調的一個重要因素。而HVA和DOPAC是DA的中間產物和最終產物，游離的HVA和DOPAC具有神經毒性，其可加重神經元細胞損傷[56]。
5-HT是中樞神經系統調節情緒水平的關鍵神經遞質和信號分子，與胃腸道功能相關，研究表明，腸道微生物可以通過控制色氨酸通路對機體的新陳代謝過程進行調節，促進5-HT代謝物5-HIAA的產生，從而抑制5-HT的合成[57]。因此，神經遞質及其代謝產物的變化可能與PD患者出現的早期胃腸道功能障礙、胃動力不足等癥狀密切相關。
本研究考察了PD大鼠結腸及紋狀體中神經遞質及其代謝產物含量的變化，結果表明PD大鼠結腸及紋狀體中DA及5-HT的代謝過程速率遠高于合成速率，而甘松醇提物能有效抑制神經遞質含量的減少和代謝分解過程，起到治療PD的作用。這也提示PD患者早期的胃腸道障礙除了與Braak提出的“dual hit”假說有關以外[24]，也可能與神經遞質含量的改變有一定相關性。
綜上，本研究證明了甘松能夠抑制ENS中過度激活的腸道膠質細胞及CNS中因α-syn錯誤折疊而過度激活的神經膠質細胞，并抑制DA及5-HT等神經遞質的代謝過程從而提高其含量，通過腸–腦軸發揮抗PD作用。PD作為世界范圍內的疾病難題，其發病機制極為復雜。本研究在傳統中醫理論“脾胃學說”和現代醫學“腸-腦軸”理論的共同指導下，探討甘松對PD模型大鼠行為的改善作用，可為入脾胃經中藥的抗PD的研究提供新思路。
利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突
參考文獻（略）
來 源：薛靜文，萬國慧，李佳園，魏曉嘉，于佳禾，楊 雪，劉朦朦， 蘆藝凡，范文昕，張 鴿，石晉麗． 基于腸-腦軸理論探討甘松對帕金森大鼠運動功能障礙的改善作用及機制 [J]. 中草藥, 2023, 54(9):2822-2831.
