結構生物學一度為RNA聚合酶的結構細節頭疼了很久。
Eva Nogales (左) 和 Jennifer Doudna合作，一起揭示Cas9中R環的作用機制。
結構生物學家一直希望能可視化大分子結構，從而探索其功能。但這需要整合多種技術，十分復雜。
與其他結構生物學家一樣，加利福尼亞大學（University of California）的Eva Nogales碰上了好時代。
Nogales現在可以利用工具解決幾年前根本無法解答的分子機器相關問題。
Nogales和Jennifer Doudna——是的，就是大名鼎鼎的CRISPR-Cas9發明人——最近在合作的一個項目就是在探索這樣的問題。很多情況下，在DNA被CRISPR-Cas9剪切前，細胞內會形成一個由核苷酸構成的R環，Doudna和Nogales都對這個R環非常感興趣。Nogales等人對化膿性鏈球菌（ Streptococcus pyogenes ）中的R環進行了成像，得到了近原子分辨率的結構圖像，提示了在特定位點Cas9酶如何打開DNA。
這項工作最突出的兩個亮點是：1，科學家們快速地將功能與結構聯系了起來；2，他們把成像方法結合了起來。一個多世紀以來，結構生物學的首選方法一直是X射線晶體衍射法。但有些生物分子太大或太小，難以結晶，因此不能采用X射線法。一些分子在發揮功能時，會發生形態或朝向的變化，而結晶法無法捕捉這些動態變化。
現在，科學家們有一個龐大的成像工具庫作為晶體法的補充。一些方法，如低溫電子顯微鏡（cryo-EM）或化學家的核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）成像，都能在不結晶的情況下，獲得接近原子分辨率的結構圖像，揭示分子的形狀、大小和方向。但并非所有的方法對細胞內所有蛋白質、核酸都有用。
經驗證明，沒有一個單一的方法足以探討在細胞中發生的動態行為和復雜的相互作用。最好的解決辦法是整合來自多個方法的圖像。
這種方法得到了諸多研究者的支持。加利福尼亞斯坦福大學（Stanford University）的結構生物學家Roger Kornberg指出，每個[方法]都能提供一些重要信息，結合起來，能實現1+1>2的效果。Kornberg由于在揭示基因轉錄的機制方面的杰出貢獻于2006獲得了諾貝爾化學獎。對于這一突破性的研究，他使用的是X射線晶體衍射法。現在，和其他的晶體學家一樣，他開始使用多種方法的結合。
Kornberg繼續分析RNA聚合酶II，但現在他把冷凍電鏡和晶體學結合起來。冷凍電鏡可用于不易結晶的分子，并且可用于解析較大的分子，但目前分辨率還比不上晶體學。Kornberg的實驗室還使用化學交聯和質譜來揭示鄰近蛋白質之間的關系，以及利用已知蛋白質的信息進行同源性建模。
Nogales和Doudna的團隊也使用混合方法來研究R環。Nogales表示，高分辨率的X射線晶體法無法解析完整的R環結構，所以他們用低分辨率的冷凍電鏡對完整的環結構進行解析。只有把兩者結合起來，研究者們才能真正揭示CRISPR-Cas9系統中R環的作用。
這種混合或綜合性方法有助于研究人員深入研究基礎科學問題，對藥物開發者也非常有用。細胞膜上發現的大蛋白質往往是治療靶標，高分辨率混合方法能揭示藥物與受體相互作用的原子細節。同樣，通過展示艾滋病毒、埃博拉病毒和其它病原體的包裝蛋白與免疫細胞相互作用的機制，誘導保護性反應，混合方法可能能夠幫助疫苗的發展。納什維爾范德堡大學（Vanderbilt University）的結構生物學家Jens Meiler表示，這些結構對于人們理解免疫系統的工作機制非常重要。
Noglaes總結到：這是混合方法的黃金時代。
夢想成真
歐洲分子生物學實驗室（European Molecular Biology Laboratory, EMBL）細胞生物和生物物理部負責人Jan Ellenberg表示，這個時代對很多生命科學家來說，是夢想成真的時代。這個夢想是從原子層面無縫銜接到細胞層面。這樣深入的理解自然能解答結構生物學的首要問題：一個分子的結構是怎么和其功能聯系在一起的？
結構生物學家工具箱中的每一種技術都提供了不同的視角。生物學家相信，使用混合方法構建的模型可以準確地反映分子或復合體在細胞中的行為。Meiler認為，你需要把這些技術結合起來，才能得到全面的答案。
X射線晶體長期以來一直是確定蛋白質原子結構的標準方法。成立于1971年的蛋白質數據銀行（Protein Data Bank, PDB）擁有的大約120000個模型中，約有90%來自晶體學研究。
但X射線晶體雖然分辨率高，但也具有局限性。首先，樣品要高度純化，以產生有序的晶體。科學家通過分析原子如何散射光來確定原子排布，從而確定分子結構。該技術需要有足夠的原子，以產生可測量的衍射圖案。并且每一個晶體必須是靜態的。因此，該方法不能揭示一個分子是如何運動的，以及如何起作用的，也不能揭示它是如何與其它系統互動的。
德國復雜系統研究所（Institute of Complex Systems）計算結構生物學小組組長Gunnar Schr02der指出，蛋白質不僅僅是一個單一的靜態結構，通常情況下，你想看到的是蛋白質的整個功能。Schr02der使用混合方法來理解蛋白的行為和與其它蛋白的互動。晶體能提供蛋白在脫離正常環境時的一個構象的快照。他還表示，結構生物學家需要其它方法來補充晶體結構的信息，并提高他們對蛋白質的形態和功能的理解。
許多蛋白質，如細胞膜上的藥物靶點，是靈活而不穩定的。為了讓這些蛋白質形成晶體，研究人員經常要在某種程度上改變它們。Meiler指出，改變樣本可能無法準確反映分子的原生狀態以及其在細胞內的排布方式。他把實驗和計算的方法混合，從而更好地理解分子結構。他繼續表示，對于很多生物系統來說，晶體法是很好的初始方法，但這個方法不足以提供功能方面的信息。
生物學家現在正在利用一系列的工具來建立更豐富、更精確的生物結構模型。混合方法得到的信息遠比單一方法豐富。冷凍電鏡和晶體法的結合就非常強大。雖然冷凍電鏡于20世紀80年代就問世了，但直到最近幾年才取得了分辨率上的突破，達到了2.2埃的分辨率，非常接近X射線結晶學的平均分辨率2埃。它可以產生蛋白質和其它大分子兩個或三個維度的圖像，這是其他方法無法實現的。
冷凍電鏡生產商FEI公司的首席科學家Jeffrey Lengyel表示，冷凍電鏡讓人激動的一點是，你可以啟動一個生化反應，然后把處于各個狀態的樣本冷凍起來。這樣，你可以確定多個構象的結構。
研究人員還可利用冷凍電鏡圖像，分析分子的運動。在加拿大多倫多兒童醫院（Hospital for Sick Children）的John Rubinstein于2015年5月發表了一項成果。他把10萬張冷凍電鏡圖像做成視頻，展示了真核V-ATP酶（細胞膜上轉運蛋白的酶）結構隨時間的變化。在今年早些時候發表的論文中，Nogales等人利用冷凍電鏡與同源模型，揭示了TFIID（一個大的、馬蹄形的、啟動基因轉錄的蛋白復合體）的結構。
一點點進步
Nogales等人使用的混合策略達到了10埃的整體分辨率，相比于以往分析TFIID的30埃分辨率是非常大的進步。分辨率的提高意味著科學家們能探索更多的問題：正如Nogales所說，“我們可以看到氨基酸與DNA相互作用。”
但冷凍電鏡要求標本被冰凍。這是不理想的生物樣品，因為冷凍的樣本遠遠脫離了自身動態、天然的狀態。核磁共振光譜（NMR）可以幫忙解決這個問題。Schr02der表示，核磁共振有一個很大的優勢——可以得到蛋白在正常狀態下的動態信息。他的實驗室通過整合NMR、冷凍電鏡和晶體學數據，得到分子模型。
NMR于20世紀40年代被首次應用到實驗中。研究人員通過在外加磁場中激發原子得到大分子結構。當原子回到靜息狀態時，它們內部磁場的變化可以被檢測到，從而反映出分子的原子結構。然而，核磁共振光譜只適用于相對較小的大分子或復合體。
結構生物學家也使用混合方法來解析超大復合體——這是過去無法完成的任務。Kornberg最新的成果（尚未發表）進一步拓展了他對RNA聚合酶II的研究，并使用混合方法描述了一個由50多個蛋白質和轉錄因子組成的巨大復合體。他表示，通過多個方法的結合，他們首次看到了整個復合體。每個方法都做出了同樣大的貢獻。
另一個超大型的目標是核孔復合體。這個膜蛋白復合體負責控制細胞核信息和分子的通過。2015年，Ellenberg等人使用一種混合方法來研究這種大型復合體。在過去，研究人員用晶體法和電子顯微鏡研究它，但他們無法獲得整個復合體的分子分辨率圖像，其整體結構在很大程度上仍然是一個謎。
Ellenberg的團隊第一次利用超高分辨率熒光顯微鏡對核孔復合體進行了成像。他指出，超分辨率熒光顯微鏡的分辨率可以達到30納米。為了提高分辨率，他們使用了一種名為單粒子平均的圖像處理技術，把分辨率提升到了10埃。冷凍電鏡的實驗證實了他們的結果。他們得到了核孔復合體的結構圖像。Nogales評價說，這樣的模型在以前是無法想象的。
同樣，多倫多大學（University of Toronto）的Rubinstein和Lewis Kay使用了混合方法打破了一些不可能。通過冷凍電鏡和核磁共振光譜的結合，他們解析了VAT酶（一種在降解蛋白中發揮重要作用的酶）的構象變化。他們通過借助冷凍電鏡解釋結構，以及核磁共振揭示動態變化，二者結合，完美展示了VAT酶工作時的情景。
仍有缺點
雖然混合方法能帶來更多的信息，但混合也會造成錯誤的疊加。因此，混合方法一個潛在的問題是，多個錯誤來源造成的誤差增加。正如Meiler所說，結構生物學家關注的一個核心問題是，如何在整合方法的同時，減小誤差，保證得到的模型具有準確性、精度和可靠性。
另一個障礙是多類數據集的共享和利用。任何一個技術都能得到豐富的信息，因此信息的共享非常麻煩。
Lengyel表示，每天都能生成百萬兆字節的數據。他希望，結構生物學領域可以向高通量的遺傳生物學領域學習處理數據超載的方法。雖然有能靈活地結合高分辨率晶體結構數據和冷凍電鏡圖的軟件，但其它方法得到的數據無法簡單地混合。例如，電子順磁共振光譜測量高分子的距離和方向，而冷凍電鏡產生密度圖。雖然這兩種數據結合在一起非常有用，但這兩種數據語言并不相同。Meiler提出疑問，這些數據如何整合？如何分享？
為了探討數據組織、共享和使用的最佳方式，幾十名結構生物學家于2014年10月齊聚英國歐洲生物信息研究所（European Bioinformatics Institute）。該會議由全球蛋白數據銀行（Worldwide Protein Data Bank）組織，是首個此類會議。
Schr02der表示，目前，PDB存儲單個蛋白結構的數據。他認為，PDB應該增加蛋白各個構象的數據。細節越豐富，越有助于全面解析蛋白和大分子功能。
學界已經做出了一些努力：目前已建立二維電子顯微鏡模型的檔案庫（Electron Microscopy Pilot Image Archive）和三維（EMDataBank）。這些檔案庫由EMBL等機構提供資金，其中包含的數據可以共享、歸檔和分發。
另一個可能阻礙該領域的威脅是專業知識。Meiler指出，技術需要投資，但投資在教育科學家上也非常重要。他建議，結構生物學領域的學生都去學習每一種方法的優缺點，并至少精通一種方法。他還表示，我們需要培養新一代的科學家，這些科學家需要理解如何整合這些不同的技術。
最后，結構生物學家必須學會提問題，提新的、復雜的、以前被認為不可能的生物問題。Ellenberg還表示，有了混合方法，很多5年前他甚至以為直到他退休都沒法探索的問題都可以解決了。
原文檢索： Stephen Ornes. (2016) Let the structural symphony begin. Nature , 536(1038):361-363.
(來源：生命奧秘Aug 22, 2016)
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