作者：麥子
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之前咱們說到從TCGA數(shù)據(jù)庫中拿到了具有明確的表型、值得進一步研究的候選基因，那么接下來就要發(fā)文章、準備基金申請的工作了。
然而要發(fā)文章又該做什么研究呢？多少錢？有哪些坑？再要申請基金該如何立題？這是今天要解決的事。
表型確認后怎么設計SCI的研究方案？
接下來，如果表型已經(jīng)幸運地確認了，又要怎么做才能讓它從一顆小種子長成參天大樹呢？
關于這一類功能基因研究的paper框架設計其實我們在很多場景中都講到，36策課程中有比較深入的講解，比如整個基礎研究是有一個5恒量3變量的系統(tǒng)，這很難在短時間內解析，所以現(xiàn)在只簡單談一談套路，其他問題大家還是去36策課中找答案吧。
功能基因的表型研究也遵循一定套路，在既定的癌癥研究方向下，會有固定的細胞模型、動物模型，有檢測指標和檢測方法。初學者可以在很多文獻中總結，仔細讀大約5-10篇文獻，大概知道這研究的套路是什么。
說到具體靶基因的研究，在第9策講了功能基因研究的5步法研究思路，這里不重復了。在第13策也介紹了做機制時在靶分子的基礎上，下游再加一個變量，去找信號通路，做間接作用機制比較快捷的3種方法。
這類文章的數(shù)據(jù)大概可分成4個部分：第1部分是臨床相關性研究，如果從TCGA切入，那臨床相關性研究的數(shù)據(jù)已經(jīng)有了一部分，可再做些自己樣本的驗證；第2部分是細胞表型實驗，如前所述；第3部分是分子機制研究；第4部分是動物模型驗證。
根據(jù)預期要發(fā)的文章的檔次，這些數(shù)據(jù)結構又有些許變化。
如果只要是SCI就行，3分以下就可以，那么有了臨床相關性研究的證據(jù)之后，再把前面驗證表型時做的那些實驗拼一拼也基本足夠。臨床相關性的證據(jù)稍微做的好一點，臨床標本的檢測和統(tǒng)計分析方法都比較簡單。
接著再在1~2株細胞中把細胞表型確認一下，通過細胞表型來解釋為什么臨床上這個指標高表達或者低表達與癌癥的發(fā)生發(fā)展有關系，這已經(jīng)構成了一個paper的完整的故事。
不過現(xiàn)在3分以下的Paper已經(jīng)越來越難用了，臨床上普遍的科研水平已經(jīng)進展到3-5分區(qū)間。此區(qū)間的一個重大特征就是數(shù)據(jù)結構更加完整，必須要有分子機制。這個區(qū)間的分子機制大多是間接作用機制為主，是信號通路的機制。
此時你需要聚焦到某一個通路，圍繞其相關分子做一些western的檢測。怎么聚焦到這個通路呢，可能前期還要有一些芯片的篩選。在這個層次中，如果用到了我在第13策和14策當中介紹的方法，我相信是比較容易搞定的。
最后那些有理想有情懷的青年，要想發(fā)5分以上paper，那么要有一個完整的數(shù)據(jù)結構，如前所說的4個部分，臨床相關性研究，細胞表型研究，分子機制研究和動物模型驗證。
還需要注意幾點。臨床相關性研究除了TCGA一定要有自己的標本，而且樣本量不要太小，至少80-100例。
在細胞表型研究中至少要提供2株細胞的表型證據(jù)，如果嚴謹一點還要嘗試做一正一反各2株細胞，即過表達和RNAi基因沉默。
在通路機制上，要比前面說的3到5分多做一步，即rescue實驗，這在之前的課里也講過很多次了哦。
最后是動物實驗，要取動物的腫瘤組織，做免疫組化也好，qPCR、Western也好，要把這個靶分子有可能影響的一些下游分子的表達變化趨勢，跟細胞水平對起來。
整體研究設計需要花多少錢？
說完了文章框架的問題，接下來就是錢。有時候有發(fā)5分的心，但是手中只有發(fā)1分的錢，太尷尬。咱們再來看看這幾部分的預算。
先說說臨床相關性研究， TCGA挖數(shù)據(jù)本質上沒有預算，除非把它全部包給公司做。驗證樣本80~100例，要是自己做實驗主要就是抗體的錢。組織芯片是比較好的研究工具，一張片子能做幾十上百例，省抗體，要不大片一張一張做，100張估計1支抗體是不夠的。
免疫組化太常用了，很多醫(yī)院的病理科也提供這樣的服務，十幾二十塊一張片子不含抗體，可以找他們合作。也有公司做免疫組化的服務，甚至常規(guī)通路的抗體直接在抗體庫里給提供了。所以這部分的預算根據(jù)樣本量的多少會有較大偏差，幾千到一兩萬不等，就算全部外包大抵不會超過2萬。
第2部分是細胞和分子實驗，主要是分子載體、病毒要采購，大概1萬。還要培養(yǎng)細胞，買相應試劑，做表型實驗也有相應試劑盒，自己做實驗的費用大概在2萬左右；如果這也外包，可能還要再加1萬左右的人工費。
現(xiàn)在3萬左右搭出去了對吧，很多人就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)手上沒錢了，接下來還有通路機制和動物實驗呢，想想要不要做呢。
如果要做通路機制探索，則很有助于提升文章檔次，預算其實也不多。推薦策略是蛋白芯片的通路篩選，加上抗體的western驗證。因為蛋白芯片技術也是基于抗原抗體反應，重復性較好。芯片幾千，再加抗體自己做驗證，估計1-1.5萬就能補上機制的數(shù)據(jù)。
如果再做rescue實驗就稍麻煩，還要訂購這個通路的抑制劑、激活劑，甚至要訂購病毒做基因操作，還要再重復表型實驗，約1萬。所以簡單通路就是1萬，再做深一點的驗證則大概2萬。
最后是動物實驗。如果自己做就是買動物和飼養(yǎng)的費用，如果是外包就主要是人工費用。動物實驗只做表型的話，一般幾千到一萬就夠，如果在機制上再做補充實驗的，就還要取瘤子，觀察一些指標，或者拍活體熒光，就會增加預算。
總的來說，整個實驗如果完全自己操作，預算約5-6萬，預期是能發(fā)到3-5分，好的話可以發(fā)過5分。如果同樣的工作量外包，預算至少要翻番。以酸菜自己運營實驗室的經(jīng)驗來說，試劑費用只占整個實驗室運營費用的20%，這就意味著如果買試劑是1萬，要外包差不多是5萬。
此類研究的客觀風險在哪里？
分析完這些可能大家感覺信心滿滿，我有錢有時間，擼起袖子就能干了。但這里要給大家稍微澆澆冷水，因為科研不是像你想象這般的美好，對其客觀風險也要有所準備。
篩選基因加驗證表型是常規(guī)的功能基因組研究策略，但也存在大量風險，解決之道除了經(jīng)驗和運氣，比較靠譜的方法就是要多有備選，即上期說的用通量解決概率問題。
實驗中我們經(jīng)常遇到過表達或者沉默一個基因，選了不同的載體則效果不同，可能細胞轉染效率低下，或者穩(wěn)轉株做不出來，細胞到后邊就不長了，又或者穩(wěn)轉株表達了一段時間，發(fā)現(xiàn)該沉默的它又恢復了。
有時候敲降了一個基因，在mRNA水平檢測其表達是降低的，但是檢測蛋白就又不像mRNA趨勢那么明顯，這也意味著有可能這個基因受到了一種轉錄后的調控機制。
這么多實驗風險使整個研究有了很多不確定性。可能細胞即使有了表型，再回過頭來檢測臨床樣本還不一定相符，此時幸好前面還有TCGA的數(shù)據(jù)，大不了標本少做一點，或者干脆不做了。
很多paper只會展示一些配對標本的檢測結果，可能就幾例，沒有自己標本的臨床相關性統(tǒng)計分析，也許不是沒做，可能是做了之后發(fā)現(xiàn)結果跟TCGA不一樣，沒法解釋。
現(xiàn)在你有了表型還發(fā)不了比較好的文章，還必須用機制去回答why，這是我們最需要突破的障礙。
我們還會遇到細胞水平的數(shù)據(jù)和動物水平的數(shù)據(jù)不可重復，細胞有表型結果上了動物就做不出來，或者說有些細胞做了穩(wěn)轉株，不成瘤，就是對照組都不成瘤，這實驗就沒法做了。
這些問題都是客觀風險，大家在開展研究之前一定要有清醒的認識，科研是一步步試錯的過程，如果經(jīng)驗豐富，每一步試錯都有風險預案，可在設計實驗時做更好的設計去避免。
總的來說當你有一顆小種子的時候，基本上這篇文章就有了，但是這篇文章是能做到3分還是5分甚至更高，除了基因的原創(chuàng)性之外，還跟后面的客觀風險有關，有時候數(shù)據(jù)做了一堆，但是有用的很少，提醒大家注意。
文章出來后，后續(xù)基金項目如何申請？
有些基金申請人前期功能基因組、篩基因、驗證表型、做機制等等工作都做好了，但是申請基金依然不好操作，為什么呢？
常見的一個問題是前期發(fā)文章的時候選的靶基因不夠新穎，都是已經(jīng)在其他癌種中報道過、有表型的，移植到自己的癌種中。這樣的策略發(fā)文章的確比較保險，但是申請國家級基金則創(chuàng)新性明顯不足，如果申請省市級小項目，可能對創(chuàng)新性的要求還沒有那么苛刻。
還有些同學前期預算太少，只能做做表型，TCGA分析一下，發(fā)一篇小文章，機制沒有了。這種情況下第一要務就是在有確定的表型的前提下，設計做機制的研究，以此申請基金，只不過這樣的前期工作相對薄弱。
如果前期文章有表型和一些機制的預實驗，就可根據(jù)預實驗的情況來對某個通路的某個靶點或者是某個關鍵的調控分子進行更深入的闡述和設計了，這才是國家基金的級別。
如果前期文章已經(jīng)有比較充分的機制實驗，比如下游信號通路已經(jīng)做好，此時的策略可以在上游再找一個調控因素，比如上游影響它的甲基化因素、轉錄因子等，對它再進行深入的探討和研究。這又形成2個變量之間的相互作用，也是國自然的水平。
如果前期文章其實已經(jīng)做的較為深入了，下游通路的分子靶點也找到了，相互作用也做了，文章也發(fā)的很好，這樣其實這基金基本已經(jīng)是你的了，你只要把申請書寫好就行。前期工作有1篇5分的paper，A類過會的幾率就很高了。
還有一個經(jīng)常在基金申請中用到的策略，就是已經(jīng)有一個靶分子時，可以通過前期的預實驗，比如做一下pull down實驗，找一下它有沒有其他的相互作用的蛋白，或者做一個RIP（RNA結合蛋白免疫沉淀），找一下它有沒有相互調控的lncRNA，在項目中引入一個新的分子，也可以形成一個新的課題。
總結一下：
1）申請基因的策略主要是在有表型前期數(shù)據(jù)的情況下往機制上延伸，通過機制的預實驗去找一個方向深入研究；
2）在已經(jīng)有下游的情況下，考慮從上游找因素進行研究設計；
3）或者直接從分子-分子交互作用，找一個新分子作為研究方向，而前面這篇文章，就作為這個新分子引出的鋪墊。
這基本上是現(xiàn)在基金申請中大家可能遇到的幾種問題的解決方案。
本文整理自酸談公開課《TCGA篩到了基因，我該如何往下做？》更多生信數(shù)據(jù)庫的使用經(jīng)驗和技巧，歡迎掃二維碼聽課~
