萬歷四十七年（1619年）中舉人，萬歷四十八年中進士，歷任南京兵部主事、兵部郎中、太原知府、山東按察使右參政等軍政要職。崇禎初年在任山東右參政時，因罪被貶為山西副使。崇禎九年（1636年）寧夏兵變，身為巡撫的丁啟睿帶兵捕斬了王輯等為首者六人，軍心安定，因功升任右布政使，分守河南，跟隨巡撫孫傳庭鎮壓農民起義軍。明朝地圖
崇禎十一年（1638年）冬，丁啟睿升任右僉都御史，代孫傳庭巡撫陜西。陜西大旱，農民起義不斷。崇禎十三年（1640年），督師楊嗣昌舉薦丁啟睿升任兵部右侍郎，代鄭崇儉總督陜西三邊軍務，鎮壓農民起義。次年升任兵部尚書，又總督湖廣、河南、四川及長江南北諸軍，仍兼總督陜西三邊軍務。
崇禎賜給丁啟睿尚方劍、飛魚服及印信。時值李自成義軍圍攻開封，丁啟睿督催傅宗龍等人率兵討伐，解圍。12月李自成再圍開封，河南巡撫高名衡飛檄報至丁啟睿，他率總兵陳永福前往討伐，陳于陣上用弓箭射中李自成左目，開封得解。1642年4月，李自成再攻開封，丁啟睿調集左良玉、虎大威、方國安諸軍以及保定總督楊文岳等部援救開封。
左良玉認為：“賊鋒銳，未可擊也”。丁啟睿說：“圍已急，必擊之！”明軍數戰不利，左良玉違令引軍夜奔襄陽。九月，李自成軍在馬家口決開黃河，水灌開封，開封失陷。丁啟睿與楊文岳逃奔汝寧，義軍追擊400里，明軍死傷無數，丁啟睿的敕書、尚方劍、印綬全部丟夫，崇禎皇帝大怒，將其革職入獄，稍后，釋放回原籍。
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