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背景介紹

脂肪組織中含有豐富的LD（脂滴），用于脂質的儲存，而不同功能的脂肪組織其LD的形態也是有所不同的，其中白色脂肪組織中的LD呈單房大LD形態，而棕色脂肪組織則主要含有多房小LD。目前，多房小LD也被認為是產熱脂肪組織的標志，目前有研究表明這些多房小LD的形成可通過提高LD表面積與體積的比例，促進脂肪分解產生FFA，FFA運輸到LD附近的線粒體中進行β-氧化和線粒體產熱。然而，產熱脂肪細胞中多房小LD的形成機制目前仍不清楚。有研究表明LD融合主要由CIDE（誘導細胞死亡的DFFA樣效應因子）蛋白調控。CIDE蛋白定位于LD表面，通過促進LD與LD接觸，并促進脂質從一個LD向另一個LD中轉移，從而使小LD轉變為大LD。關于CIDE家族，主要有三個成員：CIDEA、CIDEB、CIDEC。CIDEs以細胞類型特異性方式發揮促LD融合功能。其中白色脂肪細胞中高表達CIDEC，棕米色脂肪細胞中富含CIDEA/C，肝細胞中主要含有CIDEB。在小鼠和人類脂肪組織中的研究表明，CIDEs的缺乏可促進脂肪細胞多房小LD的形成，從而緩解肥胖相關代謝紊亂現象（小編注：CIDEA的功能與其在細胞中的定位有關，CIDEA可定位于細胞質和細胞核。有研究表明，CIDEA在細胞質中，定位于LD表面，促進LD融合。然而，也有文獻發現Cidea還具有轉錄活性功能，在誘導脂肪棕色化過程中，CIDEA蛋白水平顯著上調，使CIDEA從LD穿梭到細胞核中，特異性抑制LXRα對Ucp1增強子活性的抑制作用，促進PPARγ與Ucp1增強子的結合，從而促進Ucp1的轉錄表達，因此脂肪細胞中CIDEA的高表達也可以表征產熱水平）。然而，鑒于白色和棕米色脂肪細胞中CIDEs蛋白的高表達，但白色和棕米色脂肪細胞中又出現LD形態差異，因此，可能在棕米色脂肪細胞存在某種尚未確定的因子，特異性調控棕米色脂肪細胞中的CIDEs活性，從而影響了LDs的形態。

LD是由中性脂質、甘油三酯和固醇酯組成，被磷脂單層膜所包圍。既往研究發現LD的生物合成發生在ER（內質網）中，被廣泛接受的模型是：在ER駐留酶Dga1和Lro1（二酰甘油酰基轉移酶，催化二酰甘油與脂肪酸合成甘油三酯，是甘油三酯合成途徑的限速酶）的催化下形成甘油三酯，并在內質網的雙分子層中積累，形成晶狀體，晶狀體在細胞質中生長發芽，生成一個新的成熟的LD。新生的LD可附著在內質網膜上，也可與內質網膜分離。在2019年Nature上發表的一項研究發現，產熱脂肪細胞中特異性表達一種CLSTN3β蛋白，定位于內質網膜，通過促進S100b（棕色脂肪細胞分泌生長因子）蛋白的表達和分泌，促進棕米色脂肪細胞的交感神經支配，從而增強棕米色脂肪的產熱水平。然而，定位于內質網膜的CLSTN3β蛋白是否參與調控LD形態，目前尚不清楚。

Vineet Choudhary et al. J Cell Biol. 2015 Oct 26; 211(2): 261–271.

于2022年12月7日發表在Nature上的文章，發現CLSTN3β是產熱脂肪細胞中多房小LD形成的關鍵蛋白。CLSTN3β定位于ER-LD連接位點，通過與LD表面CIDEs結合，抑制CIDEs功能，進而抑制LD融合。而CLSTN3β的缺失可導致BAT組織形成單房大LD，并進一步損害BAT的產熱功能。總之，這一發現為產熱脂肪中多房小LD的發生機制提供了理論基礎。

敲黑板啦！

1. CLSTN3β蛋白通過N端保守的疏水發夾結構域定位于ER-LD連接位點；

2. CLSTN3β缺失導致BAT組織LD呈單房態，并損害產熱功能，而過表達CLSTN3β可促進BAT組織LD呈多房態，并促進脂質利用；

3. CLSTN3β通過抑制CIDEs功能來抑制LD融合；

4. CLSTN3β可表征人類脂肪組織的多房小LD。

研究結果

Clstn3b基因表達受寒冷和PPARγ調控

前期有研究表明CLSTN3β是Clstn3基因在產熱脂肪細胞中特異性表達產物，定位于內質網膜。為了確定CLSTN3β是否與LD的形成有關，研究人員經RNA-seq分析發現在棕色脂肪細胞分化過程中Clstn3基因表達水平顯著上調（輔圖1a）；隨后研究人員對棕色脂肪細胞中Clstn3基因RNA序列進行可視化分析發現了Clstn3的一個新轉錄本，它包含有一段先前未被注釋的外顯子序列，并與已知的Clstn3亞型的外顯子17與18相連接，研究人員將含有這段未知外顯子序列的新轉錄本定義為Clstn3b（小編注：本文作者發現了一段新的外顯子，這段外顯子位于已知的Clstn3亞型的內含子16上，與外顯子17和18相連接，將這段含有新外顯子的Clstn3亞型定義為Clstn3β）。進一步ATAC（染色質可及性分析）、CAGE（基因表達的加帽分析）以及H3K4me3-ChIP分析發現Clstn3b的表達主要由內含子16中的選擇性啟動子所驅動（輔圖1a）（小編注：全長的CLSTN3僅在大腦中表達，是一種突觸組織蛋白，促進神經元中興奮性和抑制性突觸前分化，在神經發育中發揮著重要作用）。

隨后作者詳細分析了BAT中Clstn3b的轉錄本（輔圖1b）。研究人員對大腦皮層和BAT進行了全基因組差異可變剪接分析，鑒定出了1284種差異內含子剪接事件，發現Clstn3的第16個內含子發生差異剪切并在總的事件中排名第八（輔圖1c），其在大腦皮層中該內含子被100%保留在Clstn3轉錄本中，而在BAT中存在三種不同的剪接方式，產生三種不同的Clstn3b轉錄本變體（輔圖1d），經5’RLM-RACE和RT-PCR驗證，表明BAT中確實存在三種不同的Clstn3b轉錄本變體（輔圖1e-f）。

隨后，研究人員使用靶向CLSTN3蛋白C端抗體分析棕色脂肪細胞中CLSTN3β蛋白表達，結果顯示在整個細胞裂解液中，存在一條分子量約25kDa條帶，然而分離細胞膜，提取并檢測膜蛋白，可以發現除了分子量25kDa條帶外，還存在一條分子量約為40kDa的條帶（輔圖2a），這兩個條帶均是由Clstn3b轉錄本（變體2）編碼（輔圖2b），但40kDa條帶是由Clstn3b最長ORF（開放閱讀框）所編碼，而25kDa條帶是由Clstn3b最短ORF所編碼（輔圖2c-d）。

進一步研究發現Clstn3僅在大腦中表達，而Clstn3b主要是在BAT中富集表達，在肝臟和WAT（白色脂肪組織）中表達水平較低（輔圖2g）。但研究人員發現在BAT和WAT中，Clstn3b表達水平隨環境溫度的降低而上調，這一現象與β3-腎上腺素能受體激動劑的刺激效應類似（輔圖2h-i），且脂肪細胞分化、短期HFD喂養以及PPARγ激動劑刺激也可顯著促進Clstn3b表達（輔圖2j-l）。ChIP實驗證明PPARγ與Clstn3b啟動子結合，這與已發表的ChIP-seq數據結果一致（輔圖2m-n）。總之，這些結果表明Clstn3b基因表達受寒冷和PPARγ調控。

輔圖1. Clstn3b轉錄本鑒定

輔圖2. CLSTN3β蛋白鑒定及Clstn3b轉錄調控

CLSTN3β定位于ER-LD連接位點

研究人員進一步在棕色脂肪前體細胞中過表達CLSTN3β-APEX2 C端融合蛋白（小編注：APEX2是增強抗壞血酸過氧化物酶，類似于FLAG，是一種小分子標簽），電鏡觀察發現CLSTN3β蛋白定位于ER（內質網），其C端區域朝向ER腔（圖1a）。然而，利用OA（油酸）處理棕色脂肪前體細胞或誘導其分化產生LD后，CLSTN3β僅定位于ER-LD連接位點（圖1a和輔圖3a）。且在3T3-L1細胞和Hela細胞中也觀察到CLSTN3β定位于ER-LD連接位點（圖1b-c）。使用OA處理HEK293T細胞后，提取HEK293T細胞外周膜蛋白，發現CLSTN3β并不存在于外周膜蛋白中；且CLSTN3β蛋白位于ER腔的C端可免受胰蛋白酶的消化（輔圖3b-c），表明CLSTN3β重新定位于LD上后仍是一個整合膜蛋白。此外，棕色脂肪細胞內源性CLSTN3β蛋白也定位于ER-LD接觸位點（圖1d）。

接下來，為了探究介導CLSTN3β定位于LD的結構域，研究人員探究了一系列CLSTN3β蛋白截斷突變體的定位，發現CLSTN3β蛋白N端特異性結構域對其定位于LD是必需的（圖1e-f），這表明靶向LD是CLSTN3β蛋白亞型的一個獨特功能（小編注：本文發現CLSTN3β的N端是該蛋白的特異性結構域。具體而言，研究人員構建了不同的蛋白截斷突變體，即全長的CLSTN3β蛋白、CLSTN3β N端的特異性結構域、CLSTN3β與CLSTN3共享的結構域，經免疫熒光染色發現只有全長CLSTN3β和N端特異性結構域可以與LD共定位，說明CLSTN3β N端的特異性結構域是CLSTN3β定位于LD的關鍵結構域），由于CLSTN3β與其他蛋白缺乏同源性，其N端特異性結構域并不包含已知的功能結構域。利用TMHMM預測發現三個跨膜螺旋結構域，然而這三個跨膜螺旋結構域并不具有兩親特性，不能與LD結合（輔圖3d-e）。通過蛋白二級結構預測和RoseTTAFold蛋白結構預測分析發現這三個跨膜螺旋結構可能是一組三個疏水發夾結構的一部分（輔圖3f），此外研究人員還預測到CLSTN3β特異結構域可能含有帶正電荷的兩親β鏈（輔圖3e），這些結構可能介導CLSTN3β與LD的結合。

隨后研究人員經實驗驗證發現，刪除CLSTN3β蛋白的發夾結構（ΔH123）可抑制CLSTN3β定位于LD，而刪除β鏈（Δβ）并不影響CLSTN3β的定位（圖1g），這表明疏水發夾結構是介導CLSTN3β定位于LD的關鍵結構域（小編注：研究人員利用TMHMM預測出CLSTN3β N端為3個跨膜螺旋結構，而單獨分析這3個跨膜螺旋結構，其本身不具有可以與LD結合的兩親性。隨后研究人員通過蛋白二級結構預測RoseTTAFold蛋白結構預測分析發現這3個跨膜螺旋結構組合形成了一組疏水發夾結構，該疏水發夾結構可能介導了CLSTN3β與LD的結合）。且當只刪除一個或兩個發夾結構時CLSTN3β仍可定位于LD，盡管CLSTN3β定位于LD的效率會有所降低（輔圖3g-h）。總之，這些結果表明CLSTN3β通過其N端疏水發夾結構結合LD，從而使CLSTN3β定位于ER-LD接觸位點，而其C端跨膜結構域（CLSTN3蛋白也含有）仍錨定在ER上（圖1h）。

圖1. CLSTN3β是一種ER常駐蛋白，并定位于ER-LD連接位點。

輔圖3. CLSTN3β的結構特征

定位于ER的CLSTN3β蛋白通過ER相關降解途徑降解

為了探究誘導CLSTN3β定位于ER-LD連接位點的機制，研究人員在棕色脂肪細胞中過表達CLSTN3β-APEX2-Flag，通過（1）APEX2臨近標記或（2）Flag免疫沉淀兩種途徑分離CLSTN3β相互作用蛋白，進行蛋白互作組學分析，得到287個可能與CLSTN3β蛋白相互作用的潛在蛋白（輔圖4a）。GO分析顯示這些與CLSTN3β蛋白相互作用的潛在蛋白主要富集于ERAD途徑（ER相關的蛋白降解途徑）（輔圖4b）。先前研究表明富集在LD上的含發夾結構膜蛋白由于其在ER雙分子層中的蛋白構象不穩定，導致其經ERAD途徑降解。因此，研究人員利用CB-5083（可抑制ERAD底物的降解）處理棕色脂肪細胞，發現CB-5083顯著抑制了內源性CLSTN3β的降解，表明ERAD途徑介導了CLSTN3β蛋白的降解（輔圖4c）。同樣，在Hela細胞中，CLSTN3β僅定位于小點狀結構位置，該小點狀結構可能代表Hela細胞中LD生物發生的位點，然而利用CB-5083處理Hela細胞后，CLSTN3β彌漫性分布在ER中，并不與LD結合（輔圖4d）。

在HEK293T細胞中共轉染CLSTN3β-Flag和HA-泛素蛋白后進行免疫沉淀實驗，發現CLSTN3β被泛素化修飾，且MG132或CB-5083處理后顯著抑制了泛素化CLSTN3β的降解（輔圖4e）。在CLSTN3β蛋白互作組學分析中，排名靠前的潛在蛋白為AMFR（E3連接酶自分泌運動因子受體）/gp78和UBE2G2（AMFR同源E2結合酶）。研究人員發現gp78和UBE2G2蛋白水平與HEK293T細胞中CLSTN3β蛋白水平相關，過表達gp78可顯著促進CLSTN3β蛋白泛素化，降低CLSTN3β蛋白水平，而敲減gp78則促進了CLSTN3β蛋白穩定性（輔圖4f-g）。總之，這些結果表明CLSTN3β主要富集在ER-LD連接位點，部分是由于定位于ER的CLSTN3β蛋白通過UBE2G2-gp78 ERAD途徑被降解（小編注：之前有項研究認為LD蛋白的疏水發夾結構在磷脂雙分子層膜中可能表現出一些構象不穩定或錯誤折疊蛋白的特征，從而被ERAD途徑識別并降解；而LD是由磷脂單分子層膜所包圍，當蛋白定位于LD表面，其疏水發夾可能采用更有利的構象，從而逃脫被ERAD途徑降解的命運。參考文獻：Annamaria Ruggiano, et al. EMBO J. 2016 Aug 1;35(15):1644-55. ）。

輔圖4.ER定位的CLSTN3β被ERAD途徑降解

敲除CLSTN3β可干擾LD的形態和功能

為了探究CLSTN3β蛋白的生理功能，研究人員構建了全身敲除CLSTN3β小鼠（CLSTN3β KO小鼠）和脂肪特異性敲除CLSTN3β小鼠（AdC3KO小鼠）（輔圖5a-d），在標準條件下（22℃）給小鼠飼喂正常飲食，發現雖然AdC3KO小鼠的體重和體脂與WT小鼠相似，但AdC3KO小鼠BAT組織看起來比WT小鼠BAT的體積更大、顏色更淺（圖2a和輔圖5e）。且與WT小鼠相比，AdC3KO小鼠和CLSTN3β KO小鼠BAT中TG水平更高（圖2b）。HE染色結果顯示AdC3KO小鼠BAT組織明顯發生白色化（圖2c-d）。隨后，研究人員將AdC3KO小鼠置于4℃下冷刺激4天，發現雖然AdC3KO小鼠BAT組織TG水平和LD面積顯著高于WT小鼠，但在4天的冷刺激期間AdC3KO小鼠仍可維持其核心體溫（輔圖5f-i）。然而將小鼠預先置于熱中性環境中，以排除小鼠脂肪產熱以外的其他器官的補償產熱機制，隨后對小鼠進行急性冷刺激，發現與WT小鼠相比，AdC3KO小鼠和CLSTN3β KO小鼠的核心體溫顯著降低（圖2e）。

隨后研究人員對急性冷刺激前后AdC3KO小鼠BAT組織進行RNA-seq分析，發現受寒冷調控的基因表達程序并沒有發生顯著變化（圖2f）。且在寒冷刺激或羅格列酮刺激下，雖然與WT相比，CLSTN3β的缺失顯著抑制了小鼠BAT和iWAT組織的棕色化現象，但BAT和iWAT（腹股溝白色脂肪組織）組織的經典產熱基因表達并沒有發生顯著變化（輔圖5j-l）。總之，這些結果表明脂肪組織CLSTN3β的缺失可抑制小鼠的產熱能力，而這種產熱能力的損失與產熱基因的表達水平無關。

由于CLSTN3β特異性定位于ER-LD連接位點，因此研究人員推測在產熱脂肪組織中CLSTN3β可能發揮調控脂質利用的功能。與這一假設一致的是，AdC3KO小鼠和CLSTN3β KO小鼠RER顯著高于WT鼠（圖2g），表明AdC3KO小鼠和CLSTN3β小鼠更偏向于利用碳水化合物作為能量底物。為了直接評估AdC3KO小鼠和CLSTN3β小鼠BAT中碳水化合物的利用率，研究人員利用PET-CT檢測急性寒冷刺激期間BAT攝取18F-FDG（18F-氟脫氧葡萄糖）的能力，結果顯示AdC3KO小鼠BAT中18F-FDG水平顯著高于WT小鼠（圖2h-i）。接下來，為了評估AdC3KO小鼠BAT組織的脂質利用水平，研究人員分離WT小鼠和AdC3KO小鼠BAT組織LDs，發現AdC3KO小鼠LDs上脂解相關蛋白表達水平顯著低于WT小鼠（輔圖6a-b）。而AdC3KO小鼠iWAT組織的脂解水平與WT小鼠無明顯差異，可能是由于CLSTN3β在WAT中表達水平較低（輔圖6c）。在HFD喂養下，研究人員發現AdC3KO小鼠和CLSTN3β KO小鼠BAT組織重量顯著高于WT小鼠，但體重和體脂水平與WT小鼠相似，且整體能量消耗水平與WT小鼠相比并無明顯差異（輔圖7a-e）。總之，這些結果表明脂肪組織CLSTN3β的缺失抑制了機體對脂質的利用，從而代償性利用碳水化合物作為能量來源，導致BAT脂質沉積，但這一現象并不會影響整體能量代謝平衡。

最近有研究發現CLSTN3β可促進產熱脂肪組織的交感神經支配。因此研究人員通過對AdC3KO小鼠和CLSTN3β小鼠BAT組織的交感神經纖維進行三維成像分析（輔圖8a-d），以及檢測BAT和iWAT組織中絡氨酸羥化酶蛋白水平（輔圖8e-h），以評估脂肪組織CLSTN3β對交感神經支配的調控，結果發現CLSTN3β的缺失并不影響BAT和iWAT的交感神經支配。此外，脂肪組織CLSTN3β的缺失也不影響BAT和iWAT的交感神經支配下游蛋白的變化，包括cAMP依賴性蛋白激酶底物的磷酸化修飾水平和UCP1蛋白的表達水平（輔圖8e-h）。總之，這些結果表明脂肪組織CLSTN3β的缺失并不影響交感神經支配和β-腎上腺素能信號。

圖2. CLSTN3β的缺失可干擾BAT組織LD形態和脂質利用

輔圖5. CLSTN3β缺失對產熱能力的影響

輔圖6. CLSTN3β缺失對脂解的影響

輔圖7. HFD喂養下AdC3KO小鼠和CLSTN3β KO小鼠的表型

輔圖8. CLSTN3β缺失對脂肪神經支配和β-腎上腺素能信號的影響

CLSTN3β促進脂質利用

為了進一步探究脂肪組織CLSTN3β的生理功能，研究人員構建了CLSTN3β KO棕色前體脂肪細胞系，并在該細胞系中過表達mCherry或CLSTN3β-mCherry（輔圖9a）。表型上，研究人員發現與過表達mCherry的CLSTN3β KO棕色脂肪細胞相比，在CLSTN3β KO棕色脂肪細胞中過表達CLSTN3β-mCherry顯著增加了LD的數量，并減小了LD的大小，產生“葡萄簇狀”多房小LDs。且這一現象在原代棕色脂肪細胞中也可觀察到（圖3a-c和輔圖9b）。功能上，研究人員發現過表達CLSTN3β-mCherry可促進棕色脂肪細胞的耗氧率，這是由于CLSTN3β的過表達促進了棕色脂肪細胞的脂解和脂肪酸氧化水平，而線粒體含量并無明顯變化（圖3d和輔圖9c-d）。與這一結果相一致的是，研究人員從脂肪細胞中分離LD，發現過表達CLSTN3β的脂肪細胞LD中脂解相關蛋白ATGL和CGI58表達水平顯著升高（圖3e-f和輔圖9e）。總之，這些結果表明，脂肪細胞CLSTN3以細胞自主的方式促進脂肪細胞多房小LDs的形成，并促進脂質利用。

為了研究體內過表達CLSTN3β是否也可以誘導脂肪組織多房小LDs表型，研究人員對AdC3KO小鼠尾靜脈注射AAV8-FLEX-GFP/CLSTN3β，使AdC3KO小鼠脂肪細胞中表達GFP或CLSTN3β（小編注：FLEX可調控目的基因的組織特異性表達。在AAV8-FLEX載體中，Clstn3b基因兩側分別連接兩個LoxP位點，當Cre重組酶不存在時，Clstn3b基因不表達，當Cre重組酶存在時便可誘導Clstn3b基因的表達。在本研究中，研究人員對AdC3KO小鼠尾靜脈注射AAV8-FLEX-CLSTN3β，由于AdC3KO小鼠的脂肪組織中存在Cre重組酶活性，因此可以實現CLSTN3β在脂肪組織的特異性表達）。隨后研究人員將小鼠置于4℃冷刺激4天，使脂肪細胞LD的初始大小最小化，再置于30℃刺激11天，觀察在腎上腺素能作用最小的條件下，CLSTN3β對LD表型的調控作用（小編注：研究人員將小鼠置于4℃環境冷刺激，是為了將脂肪細胞LD初始大小最小化，隨后放在熱中性環境中，促進LD的擴張，以探究在腎上腺素能作用最小的條件下，CLSTN3β對LD表型的調控作用，結果顯示與表達GFP的脂肪組織相比，過表達CLSTN3β的脂肪組織仍可維持多房小LD形態。由于cold誘導多房小LD形態的因素比較多，而在熱中性條件下觀察，排除了誘導脂肪產熱相關的因素（如腎上腺素的作用），可以更好地證明CLSTN3β對LD形態的調控作用），發現與表達GFP的小鼠相比，過表達CLSTN3β顯著促進了小鼠BAT組織多房小LDs的形成，但不影響產熱相關基因表達水平和酪氨酸羥化酶蛋白水平（圖4a-e和輔圖9f）。接下來，為了探究CLSTN3β是否也可以調控WAT組織的LD形態，研究人員對AdC3KO小鼠的asWAT（皮下脂肪組織）局部注射AAV8-FLEX，并將小鼠置于4℃下冷刺激8天，再置于30℃下刺激12天，發現與表達GFP的小鼠相比，過表達CLSTN3β顯著促進了小鼠asWAT組織多房小LDs的形成（圖4f和輔圖9g）。總之，這些結果表明CLSTN3β可促進BAT和WAT組織形成多房小LDs。

圖3. 過表達CLSTN3β可促進脂肪細胞多房小LDs的形成和脂質利用

圖4. CLSTN3β促進小鼠和人源脂肪細胞產生多房小LDs

輔圖9. 重新表達CLSTN3β的脂肪細胞和小鼠的表型

CLSTN3β表征人類脂肪細胞的多房小LDs

為了探究Clstn3b基因的進化保守性，研究人員對與鼠源Clstn3b特異性ORF相似的核苷酸序列進行BLAST搜索，發現Clstn3b基因的進化保守性僅限于胎盤哺乳動物（輔圖10a）。最早具有Clstn3b同源基因的生物之一是小馬島猬（Echinops telfairi），據報道它是一種古老的恒溫真獸類哺乳動物。雖然在非哺乳類脊椎動物中也發現了Clstn3基因，但在進化過程中Clstn3b基因出現得較晚，與脂肪產熱作為一種體溫穩態機制這一觀點的發現相一致。

研究人員對人類大腦皮層和脂肪組織中Clstn3基因進行RNA測序，結果顯示人類Clstn3基因外顯子表達模式與小鼠相似（輔圖10b）。先前研究表明Clstn3是人類單房和多房脂肪組織中表達最豐富的基因。為了驗證這一結果，研究人員檢測了健康人和嗜鉻細胞瘤患者腎上腺周脂肪組織中Clstn3基因的表達水平，結果顯示與健康人相比，嗜鉻細胞瘤患者腎上腺周多房脂肪組織中Clstn3基因表達水平顯著升高，且qPCR結果顯示Clstn3外顯子17/18和Clstn3b基因表達水平在多房脂肪組織中特異性上調（輔圖10c-d）。

隨后研究人員設計了一個可靶向結合Clstn3b特異性ORF的RNAscope探針，該探針可在人類脂肪組織中與Clstn3b基因進行RNA原位雜交。研究人員利用RNAscope探針檢測到在嗜鉻細胞瘤患者的多房脂肪組織中高表達Clstn3b基因，而健康人或嗜鉻細胞瘤患者的腎周單房脂肪組織中幾乎不表達Clstn3b基因，在人類腎周多房脂肪組織切片中（小編注：這里使用了腎周脂肪組織。腎周脂肪包圍著腎臟和腎上腺，腎上腺分泌腎上腺素和去甲腎上腺素（NE）以響應交感神經的激活，研究發現腎周多房脂肪細胞主要聚集在腎上腺附近，而腎周單房脂肪細胞聚集在遠離腎上腺的區域），Clstn3b陽性染色也僅出現在具有多房小LDs形態的脂肪細胞的細胞核附近（圖4g和輔圖10e）。最后，研究人員構建了一個來自嗜鉻細胞瘤患者的多房脂肪細胞cDNA文庫，并克隆出了人類CLSTN3β（輔圖10f），發現與小鼠相似的的是，人類CLSTN3β主要定位于脂肪細胞LDs處（輔圖10g-h）。

輔圖10. Clstn3b在人類中的保守性

CLSTN3β-CIDE相互作用抑制LD融合

在對CLSTN3β的蛋白互作組學分析中，發現與CLSTN3β相互作用的潛在蛋白主要定位于LD或ER上（圖5a），其中在8個LD蛋白中，研究人員發現CLSTN3β功能獲得表型與CIDE功能缺失表型相似，具體而言，有研究表明CIDEs蛋白C端突變可促進脂肪細胞產生多房小LDs，因此，研究人員關注到了CIDEC蛋白（圖5a）。Co-IP實驗顯示CLSTN3β可與CIDEA和CIDEC相互作用，但并不與RAB18（調控ER-LD連接位點的形成并促進LD的生長和成熟）或CGI58（小編注：CGI58定位于LD表面，是ATGL的輔激活因子，可與ATGL相互作用，促進脂解作用）相結合（圖5b和輔圖11a-c）。CIDEs蛋白C端包含可靶向結合LD的兩親螺旋結構以及調控LD融合的關鍵亞基，Co-IP實驗進一步發現CLSTN3β與CIDEs蛋白C端區域特異性結合（圖5c和輔圖11d）。此外，在共表達CLSTN3β和CIDEA的Hela細胞和3T3-L1細胞中，CIDEA仍定位于LD（圖5d和輔圖11e），表明CLSTN3β與CIDEA的相互作用并不會影響CIDE與LD的結合。

接下來，研究人員利用FRAP技術（光漂白熒光恢復技術，其原理是：用熒光物質標記細胞膜蛋白或膜脂質，借助于高強度脈沖激光來照射細胞某一區域，造成該區域熒光分子的光淬滅。如果膜蛋白是流動的，當停止激光照射后，漂白部位的熒光又可恢復，根據其恢復速度可以量化含有熒光標記探針的分子薄膜的二維橫向擴散速率。）檢測CLSTN3β對CIDE介導的脂質交換率的影響，發現過表達CLSTN3β顯著抑制了漂白LD中CIDEA和CIDEC依賴的熒光恢復（圖5e-g和輔圖11f-h），表明CLSTN3β與CIDE結合可抑制CIDE介導的脂質轉移。與這一結果相一致的是，在表達CIDEs的Hela細胞和棕色脂肪細胞中，過表達CLSTN3β可促進細胞產生多房小LDs（圖5h和輔圖12a-b）。此外，研究人員還發現在缺乏CLSTN3β的BAT組織中，CIDEA蛋白表達水平也顯著下降（圖5i和輔圖12c），這可能是由于CIDE介導的脂質轉移活性顯著增加導致LD表面積減小，從而降低了LD上CIDE蛋白水平。但CLSTN3β并不影響CIDEs蛋白N端區域的相分離功能（輔圖12d-f）。總之，這些結果表明CLSTN3β可與CIDEs相互作用，抑制CIDEs介導的脂質轉移作用，并促進脂肪細胞中多房小LDs的形成。

圖5.CLSTN3β與CIDE蛋白結合并抑制LD融合

輔圖11.CLSTN3β與CIDE蛋白結合并抑制LD融合

輔圖12.CLSTN3β與CIDE蛋白結合并抑制LD融合

總結

本篇文章發現CLSTN3β定位于ER-LD連接位點，通過抑制CIDEs介導的LD融合作用，促進脂肪細胞中多房小LDs的形成。缺乏CLSTN3β的小鼠脂肪組織LD形態呈單房大LD形態，并抑制BAT組織脂質的利用，進一步損害BAT組織的產熱能力，但并不影響脂肪組織交感神經支配和β-腎上腺素能信號。相反，過表達CLSTN3β可促進脂肪細胞形成多房小LDs表型。機制上，研究人員發現CLSTN3β通過與定位于LD的CIDEs蛋白相互作用，抑制CIDEs的脂質轉移功能，從而抑制LD融合，促進LD形成多房態。此外，研究人員還發現CLSTN3β也可表征人類脂肪組織的多房小LDs表型。總之，本篇文章發現了CLSTN3β通過調節LD表型和功能，以促進產熱脂肪細胞的脂質利用的分子機制。

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