做完甲基化測(cè)序后（當(dāng)然不止是甲基化測(cè)序，也適用于其他測(cè)序）需要對(duì)分析結(jié)果中感興趣的基因進(jìn)行生物學(xué)功能驗(yàn)證，包括分子實(shí)驗(yàn)、病毒包裝、細(xì)胞水平驗(yàn)證、動(dòng)物水平驗(yàn)證等。
基因驗(yàn)證
分子實(shí)驗(yàn)：質(zhì)粒構(gòu)建（普通基因、microRNA、lncRNA、Cas9、點(diǎn)突變、啟動(dòng)子）等。
病毒包裝：慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒
細(xì)胞水平：穩(wěn)定株構(gòu)建、蛋白與蛋白互作（BioID、GST pull down）、細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)（周期檢測(cè)、凋亡檢測(cè)、克隆形成、侵襲、遷移）、靶基因驗(yàn)證等
動(dòng)物水平：皮下成瘤、轉(zhuǎn)基因鼠、活體成像、免疫組化、免疫熒光、HE染色等
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客戶案例
摘要：
近年來(lái)，RNA水平的表觀遺傳修飾因其重要的病理生理功能越來(lái)越受到研究人員的重視。其中RNA的甲基化(m6A，N6-methyl-adenosine)修飾作為轉(zhuǎn)錄后修飾的一種成為最重要的研究靶點(diǎn)。但是RNA的甲基化修飾對(duì)于癌癥特別是肝癌的發(fā)生發(fā)展及作用目前還不是很清楚。
孫樹(shù)漢課題組在男女各20例肝癌樣本中利用q-PCR的方法檢測(cè)目前已知的RNA甲基化酶和去甲基化酶的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)RNA甲基轉(zhuǎn)移酶METTL14在肝癌中顯著下調(diào)。干擾METTL14后，利用dot blot和Northern blot方法，發(fā)現(xiàn)整體RNA甲基化水平也明顯降低。通過(guò)細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，下調(diào)表達(dá)的METTL14能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞周期進(jìn)程。在干擾METTL14的細(xì)胞系中，p21及其他細(xì)胞周期相關(guān)基因出現(xiàn)差異表達(dá)，并且這些基因包含有數(shù)據(jù)庫(kù)中的RNA甲基化位點(diǎn)。
在尋找影響METTL14表達(dá)的因素時(shí)，IL1β能夠明顯下調(diào)METTL14的表達(dá)。結(jié)果表明METTL14在肝癌中下調(diào)表達(dá)并且可能通過(guò)RNA甲基化修飾影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)從而抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，METTL14以及RNA甲基化修飾對(duì)于肝癌的發(fā)展具有重要的作用。慢病毒由和元上海提供。
詳情 ↓
1. 原發(fā)性肝細(xì)胞癌HCC中存在m6A修飾異常
作者首先使用酶標(biāo)儀對(duì)肝癌組織、癌旁組織以及正常組織中m6A的整體水平進(jìn)行了檢測(cè)，試劑盒（The m6A RNA methylation quantification kit, Abcam）原理與ELISA相似。同樣，去除rRNA后，m6A水平也顯著降低。結(jié)果表明，在HCC中無(wú)論是mRNA還是rRNA，整體m6A水平顯著降低。
2. METTL14引起HCC中m6A水平異常
下一步，作者對(duì)幾種常見(jiàn)的甲基化轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶進(jìn)行了qPCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)METTL14和FTO這兩個(gè)基因在HCC中表達(dá)量顯著降低。接下來(lái)，作者又對(duì)130個(gè)HCC隊(duì)列病人的肝癌組織和癌旁組織進(jìn)行了驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)基本符合趨勢(shì)。另外，F(xiàn)TO與METTL14也具有相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R2=0.4789。
接下來(lái)，作者對(duì)FTO和METTL14做了細(xì)胞定位后發(fā)現(xiàn)，兩種蛋白都位于細(xì)胞核中，但是兩者并不互作。敲低和過(guò)表達(dá)METTL14后，F(xiàn)TO表達(dá)量并沒(méi)有受到顯著影響。作者推測(cè)FTO在HCC中顯著降低可能是由于METTL14引起的m6A水平降低后的feedback。
下一步，作者研究了甲基化轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的另一種蛋白METTL3后發(fā)現(xiàn)，METTL3會(huì)導(dǎo)致HCC細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)。但是在HCC病人中，METTL3的表達(dá)水平卻有所降低。這個(gè)結(jié)果表明METTL3在HCC中復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。
作者使用siRNA對(duì)SMMC-7221細(xì)胞和hep3B細(xì)胞進(jìn)行METTL14敲低。斑點(diǎn)雜交結(jié)果表明m6A整體水平下降。對(duì)METTL14敲除的細(xì)胞進(jìn)行METTL14過(guò)表達(dá)補(bǔ)救后發(fā)現(xiàn)m6A水平恢復(fù)正常。
所以作者認(rèn)為HCC中m6A修飾水平異常的主要因素之一便是METTL14。
3. METTL14下調(diào)引起肝癌轉(zhuǎn)移
METTL14的水平隨著肝炎、肝硬化以及HCC逐漸顯著降低，這表明METTL14與HCC的惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)。針對(duì)130人HCC隊(duì)列研究表明，METTL14表達(dá)量降低更易引起高頻復(fù)發(fā)且生存周期降低。
后續(xù)分析表明，METTL14不僅與HCC的分化及腫瘤周期相關(guān)，還與腫瘤微衛(wèi)星、微血管轉(zhuǎn)移（microvascular invasion）等相關(guān)。HCC轉(zhuǎn)移首先會(huì)引起門(mén)靜脈癌栓（PVTT），作者在PVTT、轉(zhuǎn)移瘤HCC和非轉(zhuǎn)移瘤HCC中檢測(cè)了METTL14的表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn)，PVTT中METTL14表達(dá)量顯著降低且轉(zhuǎn)移瘤中m6A水平低于非轉(zhuǎn)移瘤。這表明METTL14還與HCC的轉(zhuǎn)移相關(guān)。
作者在其他幾種腫瘤中也對(duì)METTL14水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明METTL14在乳腺癌中表達(dá)水平顯著降低，且生存周期降低。作者推測(cè)METTL14可能與乳腺癌轉(zhuǎn)移在功能上相似。
另外，METTL14在HCC中顯著降低也與性別、乙肝病毒抗原以及微血管轉(zhuǎn)移相關(guān)，METTL14與病人生存周期相關(guān)。METTL14作為潛在的預(yù)后marker與HCC的轉(zhuǎn)移相關(guān)。
4. METTL14敲除導(dǎo)致HCC轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)
作者在SMMC-7221細(xì)胞和Hep3B細(xì)胞中進(jìn)行了METTL14 siRNA干擾。結(jié)果在METTL14敲除后，這些細(xì)胞的遷移（migration）和侵染（invasiveness）顯著增強(qiáng)。劃痕實(shí)驗(yàn)表明也表明METTL14作為一種負(fù)調(diào)控蛋白與HCC轉(zhuǎn)移相關(guān)。
下一步作者構(gòu)建了METTL14敲除的穩(wěn)定細(xì)胞株（帶熒光報(bào)告基因）并將其注射進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移模型鼠后發(fā)現(xiàn)，METTL14缺失能夠促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，并在肝臟內(nèi)發(fā)現(xiàn)更為惡化的轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。最后，作者還在發(fā)生肺癌轉(zhuǎn)移的小鼠模型中注射METTL14缺失的SMMC-7221細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)METTL14缺失會(huì)導(dǎo)致肺癌轉(zhuǎn)移惡化。
5. 過(guò)表達(dá)METTL14在HCC中抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移
與上一個(gè)實(shí)驗(yàn)相反的是，作者在這里對(duì)METTL14進(jìn)行過(guò)表達(dá)后進(jìn)行一系列細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)。下一步構(gòu)建了METTL14穩(wěn)定細(xì)胞株后注射進(jìn)腫瘤模型鼠中。無(wú)論是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)還是動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，METTL14過(guò)表達(dá)都會(huì)顯著降低腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移水平。
6. METTL14介導(dǎo)m6A修飾通過(guò)與DGCR8互作調(diào)控miR-126加工
先前已有報(bào)道稱(chēng)，DGCR8與METTL3互作，METTL3敲低會(huì)影響miRNA成熟的加工，顯著增加pri-miRNA的表達(dá)量。在本實(shí)驗(yàn)中，作者對(duì)METTL14進(jìn)行了IP實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，METTL14與DGCR8互作且由RNA介導(dǎo)。METTL14敲除或敲低顯著影響miRNA成熟體的表達(dá)水平，pri-miRNA表達(dá)水平上升。這些數(shù)據(jù)與已發(fā)布的miRNA芯片數(shù)據(jù)相符合。
作者找到了關(guān)鍵的miR-126成熟體顯著降低。已知miR-126能夠抑制HCC轉(zhuǎn)移，這個(gè)現(xiàn)象在METTL14缺陷的細(xì)胞中通過(guò)miR-126 mimics進(jìn)行表型補(bǔ)救。
在44對(duì)肝癌病人中對(duì)miR-126進(jìn)行了qPCR驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，HCC中miR-126表達(dá)量顯著降低。此外，METTL14表達(dá)量還與miR-126相關(guān)，R2=0.439。
在HCC中，miR-126成熟體加工由甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL14介導(dǎo)，miR-126成熟體表達(dá)量降低會(huì)引起HCC轉(zhuǎn)移。
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