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來源：美柏醫健

作者：cageling

基因治療技術旨在治療多種人類疾病，包括顯性和隱性遺傳疾病、癌癥、心血管疾病和神經退行性疾病。基因療法在治療隱性遺傳疾病方面取得了成功。目前正在進行的一些隱性疾病基因治療試驗額血液疾病如鐮狀細胞病和血友病、囊性纖維化、大皰性表皮松解癥和視網膜營養不良如萊伯氏先天性黑內障（Leber’s congenital amaurosis，LCA)。

基因治療還可以針對顯性遺傳疾病。由功能顯性獲得或顯性陰性突變引起的顯性遺傳疾病需要敲低突變蛋白。一種常見的敲除方法是RNA干擾(RNAi)，通常使用小干擾RNA分子(siRNA)。目前有幾種針對這些疾病的基因療法，包括Tmc1突變引起的常染色體顯性非綜合征性聽力損失、肌萎縮性側索硬化癥和1A型顯性肢帶型肌營養不良。

雖然有許多基因治療的臨床試驗在進行中，但是目前獲得FDA和/或EMA批準臨床使用的基因療法只有四種，具體見表1。

表1    目前FDA和EMA批準的基因療法

注：“費用”指單次治療費用

治療遺傳疾病更持久的策略是利用基因組編輯技術，如轉錄激活子樣效應因子核酸酶技術(TALENs)、鋅指核酸酶(ZFNs)和CRISPR-Cas9。由于CRISPR-Cas9技術設計較容易，以及它們在當前研究中的廣泛應用，本文將重點講述CRISPR-Cas9技術（圖1）。

圖1    CRISPR-Cas9用于基因組編輯

CRISPR-Cas9復合物來源于細菌和古細菌適應性免疫系統，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。化膿性葡萄球菌的CRISPR-Cas9系統可以在哺乳動物細胞中產生靶向雙鏈DNA斷裂，這一發現開啟了基因工程的一場新革命。通過在基因組DNA中創建雙鏈斷裂，位點定向內切酶可用于在DNA中創建位點特異性的、可遺傳的變化，然后通過非同源端連接(NHEJ)或同源定向修復(HDR)進行修復。通常，雙鏈斷裂對細胞極其有害，因為它們會導致染色體重排，最壞的情況下會導致腫瘤發生。然而，在基因編輯治療人類疾病時，NHEJ和HDR都有巨大的利用潛力，通過確定致病基因增強對疾病的理解，以及基因沉默或糾正致病突變基因從而直接治療疾病。

利用體外CRISPR-Cas9基因編輯技術改造誘導多能干細胞(iPSCs)已成為一種越來越有用的治療疾病的工具。例如，CRISPR-Cas9矯正的自體iPSCs目前正在用于遺傳性視網膜病變的治療。一項研究表明，導致視網膜病變(如視網膜色素變性和萊伯氏先天性黑內障)的突變可以在患者特異性干細胞中得到矯正。矯正后的誘導多能干細胞可在體外分化并移植回視網膜。

除了利用CRISPR-Cas9的核酸酶活性誘導HDR和NHEJ治療疾病外，還有大量的研究利用失活Cas9(dCas9)與反式激活蛋白結合以微調基因表達。將轉錄激活因子或抑制因子與dCas9蛋白連接，可以調節特定基因表達上調或下調(圖2 a、b)。例如，在炎癥性腸病和紅斑狼瘡等自身免疫性疾病BACH2和IL6ST等基因表達上調，dCas9連接DNMT3A可以下調BACH2和IL6ST等基因，具有潛在積極的治療作用。

圖2   dCas9調控基因表達

有許多方法可以作為基因治療的載體，包括病毒和非病毒載體，每一種都有其自身的安全性和有效性。

最常見的病毒載體包括腺病毒(AdVs)、腺相關病毒(AAVs)、逆轉錄病毒和慢病毒，而其他病毒如單純皰疹病毒和痘病毒也受到了一些關注。

AAV治療疾病的成功案例頗有希望，其中最廣為宣傳的療法是通過AAV2載體傳遞RPE65治療LCA，它使得一些患者的視覺功恢復能，并產生了持久的積極效果。

盡管AdV載體具有強大的免疫原性作用，但它仍然是實驗模型甚至癌癥等疾病基因治療的常見選擇。2004年，一種表達p53的重組AdV載體，名為Gendicine，被中國國家食品藥品監督管理局批準用于頭頸部鱗狀細胞癌的治療。

慢病毒是基因和細胞治療的常見載體。慢病毒不同于AdVs和AAVs，它可以整合到宿主基因組中，從而使轉基因得到穩定和長期的表達。雖然整合到宿主基因組有它的好處，但也有插入突變的內在風險。Kymriah (tisagenlecleucel)是一種FDA批準的CAR-T細胞療法，用于治療B細胞急性淋巴細胞白血病，該細胞就是使用慢病毒生產的。一些正在進行的基因治療臨床試驗也使用慢病毒載體，其中許多是針對造血干細胞來治療疾病，如B細胞惡性腫瘤、原發性免疫缺陷和血紅蛋白病。

除了病毒載體外還有許多非病毒載體被用來遞送基因，包括電穿孔、基因槍、流體壓力、聲孔效應、磁轉染、脂質體、納米顆粒和細胞穿透肽。

納米顆粒是基因治療中最常用的非病毒載體之一。殼聚糖是一種可降解的陽離子多糖，具有良好的耐受性，免疫原性和細胞毒性較小。這種傳遞系統已被作為載體在眼睛、胃腸粘膜和肝臟等器官組織中進行測試。在一個實驗中，將包裹編碼IL-12質粒的殼聚糖納米顆粒注射到小鼠腫瘤中，顯著抑制腫瘤生長并誘導腫瘤組織凋亡。近年來，殼聚糖已被用作基因的遞送方法治療帕金森病等神經退行性疾病。

基因治療的另一類非病毒載體是外泌體。外泌體是細胞中自然形成的包膜小泡，對細胞的許多過程都很重要，包括遺傳物質的運輸。外泌體已被用于治療軟骨損傷和骨關節炎、癌癥、心血管疾病等多個基因治療實驗。

基因治療最重要的問題之一是安全性。盡管人們普遍認為AAVs具有高安全性和低免疫原性，但AAVs已在多種動物模型中被證明可引發免疫反應。免疫反應有時可能是由于病毒攜帶的轉基因，而不是病毒衣殼本身。例如，使用rAAV2將半乳糖苷酶傳遞給野生型實驗犬會顯著激活體液免疫。在同一研究中，作者發現空載體并沒有引起這樣的免疫反應。

CRISPR-Cas9介導的基因組編輯帶來了獨特的安全挑戰，尤其是對脫靶效應的擔憂。這些脫靶事件可導致必要基因(如腫瘤抑制基因)發生危險突變，并導致基因組不穩定。在為特定基因設計gRNAs時，必須謹慎選擇。

治療遺傳性異質疾病所面臨的第一個挑戰是確定致病基因。從歷史上看，盡管在使用更便宜、更容易識別特定致病突變的方法方面已經取得了很大進展，高通量測序平臺大大降低了全基因組和外顯子組測序的成本，到2019年，全基因組測序的成本約為1000美元，但是確定致病基因仍然具有挑戰性的。

除了與基因鑒定相關的挑戰之外，基因療法在進入市場之前必須經歷的嚴格過程是非常昂貴和困難的。目前估計一種新藥上市的臨床試驗費用在1.61億美元到20億美元之間。例如，FDA批準治療RPE65引起的視網膜營養不良的基因療法Luxturna (voretigene neparvovec-rzyl)截至2017年的成本為85萬美元。雖然這種治療可能為接受治療的患者的生活質量提供顯著的飛躍，但這種經濟負擔的影響尤為明顯。另一種FDA批準的基因療法Eteplirsen使用反義寡核苷酸糾正導致DMD的異常剪接，每年每個患者的費用高達30萬美元。

簡單而言，基因治療旨在為特定基因突變的患者提供這些基因的功能拷貝。但在過去的幾十年里，基因治療已經變得復雜得多，在某些情況下可能只是需要微調基因的表達，以改善遺傳疾病的特征。雖然在基因治療方面取得了許多進展，但該領域仍存在許多挑戰。在基因治療成為遺傳病患者治療的一線選擇之前，還需要做更多的工作，特別是在開發安全和有效的載體和遞送方法方面。然而，我們相信，在不久的將來，這類療法將成為個性化治療的主要手段，并將對遺傳病患者及其家庭產生巨大的積極影響。

Gene therapy and gene correction: targets, progress, and challenges for treating humandiseases, https://doi.org/10.1038/s41434-020-00197-8.