背景
骨關節炎（OA）是老年人最常見的退行性疾病，其治療仍不理想。本研究旨在評估富血小板血漿（PRP）和臭氧（O3）聯合治療膝關節OA的療效并探討其治療機制。
方法
30只雄性家兔隨機分為5組（對照組、OA組、PRP組、O3組和PRP+O3組）。改良Hulth手術制備兔OA模型。關節大體觀察、組織病理學檢查和軟骨評分系統用于評估關節軟骨破壞情況。qRT-PCR檢測關節液中骨形態發生蛋白-2（BMP-2）mRNA的表達。免疫組化檢測軟骨組織中Ⅱ型膠原、基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）的表達。通過同側負重（PIW）不對稱百分比觀察疼痛行為。
結果
PRP患者血小板含量較全血增加6.2倍。在誘導OA組（OA、PRP、O3和PRP+O3組）中，與OA、PRP和O3組相比，PRP+O3顯著抑制手術誘導的關節大體改變、軟骨組織病理學損傷和Mankin評分的增加（P<0.05）。通過負重不對稱性觀察到的疼痛行為，在給予PRP+O3后3周和6周，PRP+O3組的疼痛行為發生逆轉（PIW不對稱性：-10.66%±1.172%）。此外，PRP、O3和PRP+O3治療后，手術誘導的BMP-2mrna表達顯著下調（P<0.01）。通過免疫組化分析，與OA、PRP和O3組相比，PRP+O3組顯著增加了軟骨II型膠原的表達，但降低了MMP-1（P<0.05）。
結論
PRP聯合O3可通過恢復進行性OA中細胞外基質合成代謝和分解代謝之間的穩態，防止軟骨破壞，改善負重不對稱性。此外，PRP和O3的組合可能比單獨使用這兩種藥物取得更好的效果。
關鍵詞
富血小板血漿（PRP）；臭氧（O3）；骨關節炎；軟骨
介紹
骨關節炎（OA）是老年人的常見疾病，是一種退行性疾病，由于影響整個關節的結構改變而導致功能紊亂。關節軟骨內環境平衡受損在OA進展中起著關鍵作用。目前，阻止骨性關節炎發生和發展的治療方法并不令人滿意。因此，有必要制定治療這種疾病的新策略。
富含血小板血漿（PRP）是從全血中分離出來的，已知它能產生高濃度的血小板和相關的信號分子，包括生長因子、趨化因子和其他細胞因子。一些研究表明，PRP在膝關節OA治療中具有刺激軟骨修復和延遲關節置換術的潛力。PRP是廣泛實驗和臨床研究的主題，因為它的最佳給藥方法、離心方案以及與其他緊密藥物的組合尚未建立。關節內臭氧（O3）溶解于滑液中，氧化抗氧化劑和多不飽和脂肪酸，產生活性氧和脂質氧化。O3具有直接和間接清除自由基的能力，可使細胞氧化還原平衡正常化，因此其抗OA進展的能力已被研究。它通過抑制基質金屬蛋白酶（MMP）和調節炎癥產生關節軟骨保護作用，炎癥通過細胞因子的作用破壞軟骨基質。我們以前的研究表明，單獨使用O3可以改善軟骨修復和功能性關節恢復，并且與各種注射藥物聯合使用也有一定的療效。研究表明，PRP和O3的聯合作用可以改善氧化應激，促進恢復，減輕疼痛和功能紊亂，使其成為治療膝關節OA的合適選擇。然而，PRP聯合O3治療OA療效的病理學證據尚不清楚。
本研究旨在為PRP聯合O3在手術誘導的兔膝關節模型上的療效提供病理學、疼痛樣行為和細胞外基質代謝方面的首次證據，為PRP聯合O3治療OA膝關節闡明理論基礎。
方法
PRP和O3制備
根據Landesberg等人報告的雙離心方案，提取自體血液樣本以制備PRP。簡而言之，通過耳靜脈用戊巴比妥（30mg/kg）靜脈深麻醉家兔后；然后從中耳動脈提取9ml全血樣本，并將其轉移到10ml含有1ml 3.8%檸檬酸鈉作為抗凝劑的真空采集器中。從每個血樣中抽取0.2mL等分試樣進行血小板計數，并以200g離心10min。第一次離心后，在新離心管中以200g離心血漿和棕黃色涂層10min。隨后，去除離心管3/4上部的貧血小板血漿，并均勻搖晃剩余液體以獲得PRP。另抽取0.2mL PRP進行血小板計數。用血液分析儀檢測全血和PRP中的血小板和白細胞計數。
使用德國卡特OZOMED醫用O3治療儀（北京新科以仁科技發展有限公司，中國，北京）以20μg/mL的濃度生成O3。
動物與實驗設計
本研究符合國家衛生研究院《實驗動物護理和使用指南》（NIH出版物第85-23號，1996年修訂版）和中國衛生部《動物管理條例》，并經清華大學第一附屬醫院機構倫理委員會（RECLA20-01）批準。從北京方圓源實驗動物有限公司（醫用實驗動物編號：SCXK2014-0012）獲得30只雄性新西蘭兔（平均體重：2.4kg）。所有兔子都被允許在有規律的晝夜循環的溫度控制環境下自由獲取食物和水。盡量限制使用動物的數量，盡量減少痛苦。設定人性化終點；在實驗期間，患有慢性或嚴重疼痛或痛苦的動物將被人道地安樂死。
所有兔均存活至治療結束。根據撲克牌抽簽結果，將30只家兔隨機分為5組（每組6只）：對照組（未治療）、OA組（OA模型）、PRP組（OA誘導兔注射0.6mL PRP）、O3組（OA誘導兔注射40μg O3）和PRP+O3組（向OA誘導的兔子注射0.6mL PRP和40μg O3）。未控制混雜因素。本文使用的樣本量和劑量是根據先前的實驗確定的，其中PRP或O3關節內注射到OA兔子體內。未設定包括和排除的標準，也未排除任何動物和數據點。由于治療的性質，只有治療師知道組分配，以確保提供正確的干預；評估員和研究人員對組分配一無所知。
根據先前的報道，通過改良的Hulth方法在實驗兔的左膝手術誘導OA具體而言，改良Hulth法的關鍵步驟包括前交叉韌帶和內側副韌帶橫斷以及半月板切除術。術后6周，將PRP、O3和PRP聯合O3注射到家兔左膝，每周注射一次，共6周。
承重分析
在左側（同側）和右側（對側）后肢之間，靜態負重分布不對稱的發展被用作關節疼痛樣癥狀的指標，表現為同側負重百分比（PIW）的下降，計算方法為同側后肢重量除以雙側后肢重量，再乘以100%。在術后0、6、9和12周，使用YLS-11A失能測試儀（中國北京Zsdc技術公司）評估靜態負重。在測試儀中，當兔子習慣于相對靜止的姿勢時，通過傳感器記錄5次試驗中每個后肢超過5秒的平均重量。在統計分析中使用每個時間點每只兔子的平均PIW。
關節液BMP-2mrna水平的測定
最后一次注射后一周，用1ml生理鹽水沖洗關節腔3次，收集關節腔中的液體，通過定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT PCR）分析方法檢測骨形態發生蛋白-2（BMP-2）的相對表達。使用TRIzol試劑（美國加利福尼亞州Invitrogen）提取關節液中的總RNA，并將其反轉錄為互補DNA（cDNA）。BMP-2的相對表達由甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH）表達水平確定，并使用2-??CT法。表1內部參考中列出了底漆序列和產品長度。
RT-PCR，逆轉錄聚合酶鏈反應；BMP-2,骨形態發生蛋白-2；GAPDH，甘油醛3-磷酸脫氫酶。
組織學分析
最后一次注射后一周，用過量戊巴比妥（120mg/kg）處死兔子，解剖左膝關節。關節軟骨標本在4%多聚甲醛中保存7天，在10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中脫鈣3個月，然后用乙醇溶液脫水。接下來，將樣品包埋在石蠟中并切割成切片，并根據Mankin評分系統用蘇木精和伊紅（H&E）或甲苯胺藍（TB）染色進行組織學評估，包括軟骨表面損傷、結構損傷、基質染色缺失，潮標完整性和病變部位比例的喪失。
免疫組化分析
評估II型膠原和MMP-1的免疫反應性。簡言之，內源性過氧化物酶活性被0.3%H2O2阻斷30分鐘，然后用PBS沖洗并用牛血清白蛋白V阻斷液阻斷30分鐘。切片在4℃下與抗II型膠原（1:200，Proteintech，CA，USA）或MMP-1（1:100，Proteintech，CA，USA）的抗體一起孵育過夜。用PBS沖洗后，切片用山羊抗兔IgG孵育，并用DAB顯色劑顯影。通過計算陽性染色的軟骨細胞數量來估計軟骨中抗原的存在。使用Image Pro Plus 5.1版軟件計算關節軟骨三個中心區域的總軟骨細胞數和陽性染色軟骨細胞數。測定各組抗原染色陽性細胞百分率。
結果
主要結果是軟骨改變和破壞的程度。次要結果是負重不對稱和細胞外基質代謝的改善。
統計分析
數據以平均值±標準偏差（SD）表示。使用SPSS 21.0（美國紐約國際商用機器公司）軟件和GraphPad Prism 8.0（美國加利福尼亞州GraphPad軟件公司）軟件進行統計分析。數據的正態分布通過D'Agostino和Pearson正態性檢驗進行檢驗。如果數據不呈現正態分布，則使用非參數分析。
通過雙向方差分析（ANOVA）評估PIW不對稱性隨時間的差異，然后進行Bonferroni后測，以比較兩個以上組之間的差異。多組間的其他數據評估采用單因素方差分析和Tukey后檢驗。當P<0.05時，結果具有統計學意義。
結果
PRP的評估
根據圖1A所示的關節內策略，用PRP、O3或PRP+O3治療Hulth誘導的OA兔。在PRP和PRP+O3組的血液樣本中，全血和PRP中的血小板平均濃度分別為346.25±63.57×10E9/L和2151.75±439.25×10E9/L。PRP組血小板密度是外周血的6.2倍，差異有顯著性（P<0.05）。相比之下，PRP中的白細胞計數相對于全血減少。對于全血，平均白細胞計數為9.84±1.14×10E9/L，而對于PRP，平均白細胞計數為2.39±0.92×10E9/L。這些數據表明制備的PRP不富含白細胞。
圖1關節內注射的設計和股骨關節面的大體外觀比較。（A） 左膝示意圖顯示了關節內注射的方案。（B） 治療6周后關節面（股骨）骨關節炎嚴重程度的代表性大體圖像。紅色框表示OA檢查的區域。圖像的放大倍數為×2。所有組（n=6）。OA，骨性關節炎；PRP，富血小板血漿；O3，臭氧。
PRP聯合O3減輕OA兔關節大體改變
OA組的大體關節觀察顯示前交叉韌帶和內側半月板缺失，OA發生顯著變化，包括軟骨侵蝕、骨贅形成、股骨周圍滑膜水腫和增厚（圖1B）。視覺觀察結果與OA特征一致（24），表明OA成功誘導。然而，在PRP、O3和PRP聯合O3處理的兔子中觀察到軟骨缺損和滑膜厚度顯著減少。
PRP聯合O3預防OA兔軟骨破壞
在OA組兔子中，與對照組兔子相比，H&E和TB染色顯示表面軟骨損傷顯著增加，軟骨細胞排列紊亂，細胞外基質染色不均勻（圖2A、2B）。相比之下，與OA組相比，PRP、O3和PRP+O3組的治療導致關節軟骨的表面損失和軟骨細胞紊亂更少。同時，與PRP和O3組相比，PRP+O3組細胞外基質染色清晰均勻。OA組的關節Mankin評分（圖2C）與對照組相比顯著增加（P<0.01）。盡管PRP或O3暴露均導致曼金評分穩步下降（均P<0.05），但與單一藥劑相比，PRP+O3組合顯示出更高的保護作用（P<0.05）。
圖2關節面（股骨）軟骨的組織學圖像和分析。（A） 關節軟骨的H&E和（B）TB染色切片。標尺：50μm。（C） 用Mankin評分系統評估軟骨破壞情況。所有組（n=6）。與對照組相比，各組之間存在顯著差異，如**P<0.01；與OA比較，P<0.05，P<0.01；并與PRP+O3作了比較?P<0.05。H&E、蘇木精和曙紅；TB，甲苯胺藍；OA，骨性關節炎；PRP，富血小板血漿；O3，臭氧。
PRP聯合O3改善OA兔負重不對稱性
通過負重分析檢測改良Hulth手術后疼痛樣癥狀的進展（表2）。在基線檢查時，所有實驗兔的PIW接近50%。定量數據顯示，與基線相比，所有OA誘導的兔子（OA組、PRP組、O3組和PRP+O3組）在術后各時間點（術后6、9、12周）的PIW均顯著降低（P<0.05）。術后6周，即首次治療前，OA誘導的兔子之間的PIW沒有顯著差異。術后9周，O3組和PRP+O3組的負重評分明顯優于PRP組（P<0.05，P<0.01）。12周后，PRP+O3組的PIW優于O3組（P<0.01，P<0.05）。PRP聯合O3對OA兔靜態負重不對稱性的減輕作用比單次治療更早、更明顯。
與基線檢查相比，各組間差異顯著，如*P<0.01；與術后6周比較，P<0.05，P<0.01。PIW，同側負重百分比；OA，骨性關節炎；PRP，富血小板血漿；O3，臭氧。
PRP聯合O3對OA兔細胞外基質相關基因的調控
BMP-2與細胞外基質的合成代謝和骨贅形成密切相關。如圖3所示，骨關節炎組兔關節液中BMP-2的相對mRNA表達高于對照組兔（P<0.01）。與OA組相比，PRP、O3和PRP+O3組BMP-2mrna表達降低（P<0.01，P<0.01，P<0.01）。
圖3通過qRT PCR檢測關節液中BMP-2的mRNA表達水平。GAPDH被用作內部控制。所有組（n=6）。與對照組相比，各組之間存在顯著差異，如**P<0.01；與OA相比，as###P<0.01。BMP-2，骨形態發生蛋白-2；qRTPCR，定量逆轉錄聚合酶鏈反應；GAPDH，3-磷酸甘油醛脫氫酶；OA，骨性關節炎；PRP，富血小板血漿；O3，臭氧。
進行免疫組織化學實驗以評估OA兔軟骨中細胞外基質的分解代謝情況（圖4A、4B）。PRP和/或O3治療可在很大程度上逆轉手術誘導的軟骨中II型膠原的減少，而關節內治療后關節炎模型中MMP-1表達的增加顯著下調。值得注意的是，PRP+O3的改善效果比單獨使用PRP或O3更明顯（P<0.05）。
圖4（A，B）股骨關節面切片中II型膠原和MMP-1的免疫組織化學分析。標尺：50μm。所有組（n=6）。與對照組相比，各組之間存在顯著差異，如*P<0.05；與骨性關節炎比較#P<0.05；并與PRP+O3作了比較?P<0.05，??P<0.01。MMP-1，基質金屬蛋白酶-1；OA，骨性關節炎；PRP，富血小板血漿；O3，臭氧。
討論
我們的研究結果表明，PRP和O3聯合應用對手術誘發OA的進展具有良好的效果。結果顯示，在使用PRP+O3后，這種組合對關節損傷的預防有效果，并提高了同側后肢的靜態負重百分比。最后，我們發現PRP+O3可降低滑膜BMP-2 mRNA表達水平和軟骨II型膠原和MMP-1免疫標記軟骨細胞的數量。這些發現提供了可靠的證據，表明PRP與O3聯合調節細胞外基質代謝的穩態，從而防止軟骨破壞和改善兔OA的負重不對稱性。值得注意的是，我們目前的研究包括對照組以及聯合治療后軟骨外觀的直接病理學證據。
骨性關節炎是一種使人衰弱的疾病，會降低老年人的生活質量并導致永久性殘疾。在骨性關節炎的臨床情況下，一種簡單的藥物不能同時解決癥狀和病理學問題。因此，在OA管理中需要尋找具有互補機制的潛在多模式治療。PRP被認為通過影響軟骨退行性進展的整個關節環境來進行短期臨床改善。臨床結果可能受到方法學變量的影響，需要對這些變量進行研究，以優化關節內PRP治療OA進展。最近，Dernek等人表明，與單獨的PRP治療相比，接受PRP治療聯合O3治療的患者能夠更早地緩解OA癥狀。然而，由于其回顧性和缺乏組織病理學檢查來證明關節軟骨的改善，本研究存在一些局限性。
越來越多的人認識到，關節軟骨的內環境平衡受損有助于OA的發病機制和進展。事實上，許多細胞因子與關節成分降解相關，這超過了修復能力，導致OA關節細胞外基質降解。BMP-2是TGF-β超家族中參與分化的關鍵因子之一，在軟骨形成的各個階段，包括II型膠原的合成和軟骨細胞合成代謝的調節，都顯示出重要的作用。盡管BMP-2具有強大的合成代謝作用，但它也可導致聚集蛋白聚糖的降解并促進OA樣軟骨的丟失。根據骨性關節炎的程度，BMP-2水平在不同的骨性關節炎軟骨層和骨贅生物中升高。此外，刺激促炎細胞因子IL-1β和TNF-α可增加軟骨細胞中活性BMP-2的表達。研究表明，關節軟骨中慢性低度炎癥的存在有助于OA的發展。所有這些都表明BMP-2在OA的發病過程中起著關鍵作用。最近的研究表明，關節液BMP-2濃度與膝OA關節損傷的影像學和癥狀嚴重程度有顯著相關性。創傷后關節中BMP-2水平的上調可通過促進基質合成促進組織修復，而另一方面通過刺激MMPs表達導致膠原更高水平的變性。據報道，MMP家族通過在軟骨基質成分的降解調節中發揮關鍵作用，在進行性OA中起主要作用。MMP-1是一種限速II型膠原酶，引起細胞外基質的降解和破壞，并激活其他MMP家族成員在OA中發揮重要作用。與先前的研究結果一致，Hulth誘導的OA兔關節液中BMP-2 mRNA表達升高，關節軟骨中MMP-1表達升高。此外，在我們的OA模型中，組織病理學改變包括軟骨基質的破壞和鈣化。簡言之，這些發現表明，在OA進展過程中，BMP-2 mRNA的滑膜表達與細胞外基質的降解密切相關。
一些研究證實，PRP濃縮了多種血小板、生長因子和生物活性成分，為細胞增殖和基質積累提供了合適的微環境。在我們的研究中，闡明了PRP與O3聯合抑制的時間及其效果。作為軟骨修復的直接和間接氧化劑，O3可在關節內產生活性氧產物和脂質氧化產物。最近的研究表明，氧化脂質可刺激血小板活化，確保在纖維蛋白收縮和纖維蛋白溶解期間觸發凝血級聯反應，可能通過將PRP限制在關節腔來提高療效。我們假設PRP與O3結合可能協調信號元件的釋放，使PRP更好地粘附于軟骨表面和滑膜，并抑制降解膝OA細胞外基質的MMP的釋放。這可能解釋了PRP聯合O3具有更好的治療效果。
在膝關節骨性關節炎中，疼痛是突出的癥狀，是臨床決策的主要驅動力。負重分析的分布對于評估OA引起的疼痛非常重要，膝關節OA患者常出現同側下肢無力。我們先前的研究表明關節內O3注射改善了OA兔的靜態負重不對稱性。類似地，Gowler等人使用負重不對稱性來評估手術誘導的動物OA模型的鎮痛效果。在本研究中，PRP和O3的聯合使用協同促進了軟骨保護和分解代謝的減少，從而最終增強了同側負重恢復，這與先前的研究一致，這些研究表明關節內穩態有助于OA鎮痛作用。
Hulth誘導的模型導致關節不穩定，產生創傷性OA，并可靠地模擬人類OA的發病機制和病理改變。在這項研究中，主要的限制是沒有使用不同劑量的對照組，主要是因為實驗動物數量有限。盡管需要進行更多研究，以確定最佳PRP制備方案和劑量方案，這些結果證實了PRP和O3聯合使用能夠逆轉與OA相關的細胞外基質分解代謝，從而建立保護關節軟骨和改善OA進展引起的負重行為改變的治療能力。
結論
在這項動物研究中，我們評估了關節內注射PRP和O3聯合治療膝關節骨性關節炎是一種有前途的策略，并且可能優于單獨注射PRP或O3。此外，PRP聯合O3的保護作用可能參與了細胞外基質的代謝穩態調節。
本文翻譯由中德卡特醫學顧問焦子天完成，文中可能稍有紕漏，敬請見諒。如需原文請與小編聯系。
