內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不僅是蛋白質(zhì)折疊和成熟的主要場所，也是營養(yǎng)物質(zhì)感知和處理的主要場所。研究發(fā)現(xiàn)細胞代謝紊亂可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，也稱為“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激”，從而觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）。UPR反應(yīng)是調(diào)控細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的反應(yīng)，旨在恢復(fù)蛋白質(zhì)的平衡狀態(tài)，以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能和細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。UPR主要通過三個信號蛋白發(fā)揮作用，即IRE1α（肌醇需求蛋白-1α）、PERK（蛋白激酶RNA樣ER激酶）和ATF6（激活轉(zhuǎn)錄因子6）。PERK和ATF6通過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)常駐伴侶蛋白BiP結(jié)合以調(diào)節(jié)UPR，而IRE1α則直接與未折疊蛋白結(jié)合而被激活，從而激活UPR，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能和細胞代謝穩(wěn)態(tài)。IRE1α是一種跨膜蛋白，具有Ser/Thr蛋白激酶和核糖核酸內(nèi)切酶（RNase）活性。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白的累積促進IRE1α在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上發(fā)生二聚化，并通過自身磷酸化激活其RNase活性。一方面，RNase活性可以催化XBP-1（X-box 結(jié)合蛋白-1）mRNA的剪接，生成具有活性的轉(zhuǎn)錄因子XBP-1s。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下，IRE1α被激活并誘導(dǎo)XBP-1 mRNA形成剪接形式的XBP-1s，通過直接與ERSE（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激響應(yīng)元件）相互結(jié)合，進一步增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，以應(yīng)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；另一方面，其RNase活性還可以選擇性降解mRNA，這一過程稱為RIDD（IRE1α依賴性調(diào)節(jié)降解）。有研究發(fā)現(xiàn)在損傷誘導(dǎo)的肌肉再生過程中IRE1α高表達，IRE1α通過其RIDD活性下調(diào)Myostatin（肌肉修復(fù)和再生的負調(diào)控因子）mRNA水平，從而維持肌細胞的分化和再生。 研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物中IRE1α能夠在不同代謝組織中感應(yīng)機體的營養(yǎng)代謝狀態(tài)，參與調(diào)節(jié)多種糖脂代謝過程，例如：營養(yǎng)過剩狀態(tài)下，IRE1α可通過剪接XBP1和RIDD兩種功能共同抑制巨噬細胞向M2型極化，進而誘發(fā)脂肪組織炎癥反應(yīng)，降低機體能量消耗，從而促進肥胖的發(fā)生，而骨髓特異性敲除IRE1α可預(yù)防飲食誘導(dǎo)的肥胖。然而，脂肪細胞IRE1α是否以及如何調(diào)控脂肪組織功能，目前還不清楚。
敲黑板啦！
IRE1a缺失可促進WAT棕色化和脂解作用
IRE1α缺失可促進米色脂肪產(chǎn)熱
IRE1α通過PGC1α抑制產(chǎn)熱基因表達
IRE1a通過其RIDD活性抑制PGC1α表達
脂肪細胞中IRE1α的缺失可緩解飲食誘導(dǎo)的肥胖，并進一步促進β3-AR激動劑的抗肥胖作用
研究結(jié)果
1．脂肪細胞IRE1a缺失促進冷誘導(dǎo)的白色脂肪組織棕色化
為了探究在寒冷誘導(dǎo)脂肪重塑條件下脂肪組織IRE1α是否被激活，研究人員將小鼠置于8℃下冷刺激60min后，發(fā)現(xiàn)iWAT和BAT組織中IRE1α Ser724位點磷酸化水平顯著升高，且剪接形式XBP1s蛋白水平也明顯上調(diào)，而典型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志物Chop和BiP表達并沒有明顯變化，同時在冷刺激下eWAT組織中IRE1α-XBP1s通路活性并沒有顯著變化(圖1a)，表明在寒冷刺激下，IRE1α在iWAT和BAT中特異性激活。隨后，為了進一步探究寒冷誘導(dǎo)IRE1α的激活是否參與調(diào)控了脂肪組織產(chǎn)熱作用，研究人員將Ern1（即Ire1α）fl/fl小鼠分別與Adipoq-Cre和Ucp1-iCre小鼠雜交，構(gòu)建Ern1 AKO（脂肪組織特異性敲除IRE1α）和Ern1 BKO（小編注：有研究報道UCP1-Cre在靶向敲除米色脂肪中靶基因的效率較低，在室溫下Ucp1-Cre小鼠在BAT中特異性表達Cre，在短期冷刺激（6h）下iWAT組織幾乎不表達Cre；而長期冷刺激（6天）下iWAT組織Cre表達顯著上調(diào) 參考文獻：Xingxing Kong, et al. Cell. 2014。 本文中研究人員利用Rosa26mTmG報告小鼠驗證了UCP1-iCre在米色脂肪中敲除IRE1α的效率，免疫染色發(fā)現(xiàn)Ern1 BKO小鼠在8℃冷刺激3天后，iWAT中IRE1α表達量僅下降5%（附圖2s-t）；而長期冷刺激（8℃刺激15天）Ern1 BKO小鼠，免疫染色結(jié)果顯示iWAT中IRE1α表達量下降約45%（附圖8a-c）；表明長期冷刺激才足以誘導(dǎo)iWAT中Cre的表達，并高效靶向敲除iWAT中的靶基因），將小鼠置于熱中性環(huán)境（30℃）中飼養(yǎng)6周后進行冷刺激(圖 1b)，發(fā)現(xiàn)在30℃條件下，與Ern1fl/fl小鼠相比，Ern1 AKO小鼠和Ern1 BKO小鼠體重、攝食量、活動量、代謝率以及RER等代謝指標均沒有顯著變化(附圖1a–n)。然而，在8℃下進行急性冷刺激后，與Ern1fl/fl小鼠相比，Ern1AKO小鼠的核心體溫顯著升高，且寒冷刺激3天后Ern1 AKO小鼠體重明顯降低，代謝率和產(chǎn)熱量也明顯升高，而Ern1 BKO小鼠在冷刺激下代謝指標并沒有發(fā)生明顯變化，此外在冷刺激下Ern1 AKO和Ern1 BKO小鼠的活動量和RER并沒有明顯變化(圖1c-f，附圖2a-d)。接下來，為了探究脂肪組織特異性缺失IRE1α是否影響脂肪組織棕色化過程，研究人員將小鼠置于8℃環(huán)境下冷刺激3天，發(fā)現(xiàn)Ern1 AKO小鼠iWAT組織重量顯著下降，而Ern1 BKO小鼠iWAT組織重量無顯著變化；此外Ern1 AKO小鼠eWAT組織重量和組織形態(tài)均無明顯變化，而BAT組織重量下降，且脂質(zhì)積累降低(圖1g，附圖2e-i)。有意思的是，在冷刺激3天后，Ern1 AKO小鼠iWAT組織發(fā)生明顯棕色化現(xiàn)象，且UCP1蛋白表達顯著上調(diào)，而Ern1 BKO小鼠并沒有發(fā)生這一現(xiàn)象(圖1h–j和附圖2j–l)。此外研究人員還發(fā)現(xiàn)冷刺激1h可顯著促進Ern1fl/fl小鼠iWAT和BAT組織中IRE1α Ser724位點磷酸化修飾水平(附圖2m)，先前研究在分化的棕色脂肪細胞中也觀察到CL316,243刺激促進IRE1α Ser724磷酸化修飾上調(diào)這一現(xiàn)象，因此研究人員推測急性冷刺激促進IRE1α Ser724位點磷酸化可能是兒茶酚胺激活PKA所引起的，然而在冷刺激3天后并沒有檢測到Ern1fl/fl小鼠iWAT組織中IRE1α Ser724磷酸化修飾(附圖2m)（小編注：這里的三天后不一定是IRE1α沒有磷酸化激活，而只是Ser724位點磷酸化水平下降。IRE1α有多個磷酸化位點，都可以激活其功能，也有可能是長期冷刺激下其他位點的磷酸化發(fā)生改變激活。本文針對這里的解釋是短期冷刺激可能通過兒茶酚胺激活PKA，促進IRE1α Ser724磷酸化來激活I(lǐng)RE1α活性，而長期冷刺激下，可能是由脂解釋放的脂肪酸來激活I(lǐng)RE1α的活性。在之前對IRE1α在BAT功能的研究中，也發(fā)現(xiàn)該蛋白在CL316,243刺激30min時IRE1α Ser724位點發(fā)生磷酸化修飾，而CL316,243刺激6h后IRE1α Ser724位點磷酸化修飾水平下降，該研究討論可能是長期CL316,243刺激與短期效應(yīng)不同，誘導(dǎo)了IRE1α其他位點的磷酸化修飾。 參考文獻：Rie Asada, et al. Sci Rep. 2015; Christiane Rennert, et al. Int J Mol Sci. 2020），這一現(xiàn)象提示可能是在脂肪重塑過程中所釋放其他代謝物激活了IRE1α，如脂解產(chǎn)生的脂肪酸。此外研究人員還發(fā)現(xiàn)寒冷刺激3天后Ern1 AKO小鼠iWAT組織UCP1蛋白表達顯著上調(diào)，而BAT中UCP1表達無明顯變化；同時寒冷刺激Ern1 BKO小鼠3天，小鼠iWAT和BAT組織中UCP1表達也均無明顯變化(圖1k-l，附圖2n-o)。這些結(jié)果表明脂肪組織IRE1α主要發(fā)揮著抑制寒冷誘導(dǎo)iWAT棕色化的作用，而BAT特異性缺失IRE1α并不能影響小鼠產(chǎn)熱能力，說明IRE1α可能以組織特異性的方式調(diào)控脂肪產(chǎn)熱。
有研究表明UCP1-Cre系統(tǒng)不能有效靶向敲除米色脂肪中的目的基因。因此研究人員檢測了Ern1fl/fl小鼠與UCP1-iCre小鼠雜交構(gòu)建的Ern1 BKO小鼠中，冷刺激條件下高表達UCP1的米色脂肪組織中IRE1α的表達量，發(fā)現(xiàn)iWAT組織中IRE1α基因和蛋白表達水平基本不變，而BAT組織中IRE1α表達水平顯著降低(附圖2n-q)。為了進一步證明這一結(jié)果，研究人員將Rosa26mTmG報告小鼠與Ucp1-iCre小鼠雜交，Cre活性低的組織表達具有紅色熒光的tdTomato蛋白（mT），Cre活性高的組織則表達具有綠色熒光的eGFP蛋白（mG）(附圖2r)。隨后，研究人員將Ern1fl/fl小鼠，Ucp1-iCre小鼠和Rosa26mTmG報告小鼠雜交，以檢測BAT組織以及寒冷刺激下高表達UCP1的iWAT組織中IRE1α的敲減效率，發(fā)現(xiàn)寒冷刺激3天后Ern1 BKO小鼠BAT組織中IRE1α表達顯著下調(diào)，而iWAT中IRE1α表達量只略微有所降低(附圖2s-t)。這些結(jié)果表明在寒冷刺激3天后，Ern1 BKO小鼠核心體溫并不能像Ern1 AKO小鼠一樣增加，可能是由于UCP1-iCre系統(tǒng)不能有效敲除iWAT中IRE1α，這說明 IRE1α可能通過調(diào)控iWAT組織中白色脂肪和米色脂肪的轉(zhuǎn)化，以發(fā)揮抑制脂肪產(chǎn)熱的作用。
2．IRE1a缺失可促進WAT棕色化和脂解作用
寒冷刺激可促進兒茶酚胺的釋放，激活β3-AR，從而促進脂肪組織產(chǎn)熱。為了探究脂肪組織IRE1α是否通過調(diào)控β3-AR活性來影響脂肪產(chǎn)熱的，研究人員對小鼠連續(xù)3天腹腔注射CL316,243（β3-AR激動劑，可激活脂肪產(chǎn)熱），發(fā)現(xiàn)Ern1 AKO小鼠的耗氧量和產(chǎn)熱量顯著升高，而活動量和RER并沒有明顯變化，表明激活β3-AR后，Ern1 AKO小鼠的能量消耗增加，而利用碳水化合物和脂質(zhì)的比例并沒有變化(圖2a和附圖3a–c),同時Ern1 AKO小鼠的體重和iWAT組織重量顯著降低，且iWAT組織UCP1表達顯著上調(diào)，并發(fā)生顯著棕色化現(xiàn)象(圖2b-2f)，此外，研究人員分離小鼠iWAT組織進行Seahorse分析，發(fā)現(xiàn)在NE（去甲腎上腺素）刺激下，Ern1 AKO小鼠iWAT組織的耗氧率（OCR）顯著升高(圖2g)。總之，這些結(jié)果表明，脂肪細胞IRE1α的缺失可進一步增強β3-AR激動劑誘導(dǎo)的脂肪棕色化現(xiàn)象，從而促進脂肪產(chǎn)熱能力。
由于寒冷刺激或β3-AR激動劑刺激可促進WAT脂解，釋放的游離脂肪酸可激活UCP1并促進脂肪產(chǎn)熱。因此，接下來研究人員想要探究脂肪組織IRE1α的缺失是否可以促進iWAT脂解，研究發(fā)腹腔現(xiàn)注射CL316,243后，Ern1 AKO小鼠血液中甘油和FFA水平顯著升高(圖2h-i)，同樣，體外脂解實驗結(jié)果表明CL316,243刺激后Ern1 AKO小鼠iWAT組織釋放的甘油和FFA含量明顯升高，而Ern1 BKO小鼠iWAT組織并沒有這一現(xiàn)象(圖2j-k，附圖4a-b)。然而，腹腔注射CL316,243后，與Ern1fl/fl小鼠相比，Ern1 AKO小鼠iWAT組織中HSL磷酸化水平和ATGL表達水平（小編注：在脂解過程中，兒茶酚胺促進PKA誘導(dǎo)PLIN1磷酸化，PLIN1磷酸化后與CGI-58解離，CGI-58與ATGL結(jié)合并激活A(yù)TGL活性；同時PKA也誘導(dǎo)HSL發(fā)生磷酸化修飾從而激活HSL活性。因此ATGL的磷酸化修飾并不是脂解過程所必需的，有很多文章只檢測了ATGL表達水平。ATGL也可以被AMPK刺激發(fā)生磷酸化修飾，ATGL磷酸化修飾可增加其脂解活性。 參考文獻：Alexander Yang, Emilio P Mottillo. Biochem J. 2020；Yunfan Yang, Nat Commun. 2020）。并沒有明顯變化(圖2l-m)，表明脂肪組織IRE1α對脂解的抑制作用并不是由β3-AR調(diào)控脂解的經(jīng)典信號途徑所調(diào)控。總之，這些結(jié)果說明脂肪組織IRE1α的缺失可促進WAT脂解，從而進一步增強脂肪組織產(chǎn)熱。
3．IRE1α缺失可促進米色脂肪細胞產(chǎn)熱
接下來，為了探究IRE1α能否以細胞自主方式抑制iWAT產(chǎn)熱，研究人員分離了Ern1fl/fl小鼠、Ern1 AKO小鼠和Ern1 BKO小鼠iWAT組織中的SVF細胞，并誘導(dǎo)其分化為成熟的原代脂肪細胞，發(fā)現(xiàn)iWAT組織缺失IRE1α并不影響SVF前體脂肪細胞的成脂分化，且UCP-iCre也不能有效敲除iWAT組織中IRE1α(圖3a-b和附圖5a-f)，同樣，在CL316,243刺激下，成熟的Ern1 AKO原代脂肪細胞中UCP1表達水平顯著上調(diào)，而CREB蛋白磷酸化水平?jīng)]有顯著變化（小編注：CREB通過其磷酸化修飾發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，在脂肪細胞中，CREB可促進C/EBPα和PPARγ的表達，從而促進脂肪細胞分化。本研究發(fā)現(xiàn)與Ern1fl/fl原代脂肪細胞相比，Ern1 AKO原代脂肪細胞中CREB磷酸化水平?jīng)]有明顯變化，說明Ern1并不參與調(diào)控脂肪分化過程。參考文獻：Evan D Rosen, Ormond A MacDougald. Nat Rev Mol Cell Biol. 2006）；且Ern1 AKO脂肪細胞OCR水平顯著升高(圖3c-d和附圖5g)。此外，CL316，243刺激下Ern1 AKO原代脂肪細胞的FAO（脂肪酸氧化)顯著增強，F(xiàn)AO途徑關(guān)鍵基因也顯著上調(diào)(圖3e-f)。電子顯微鏡成像顯示在CL316,243刺激下Ern1 AKO脂肪細胞中脂滴變小，這表明脂肪細胞IRE1α的缺失可促進脂解，以促進脂肪產(chǎn)熱(圖3g)。然而，Ern1 AKO脂肪細胞中線粒體形態(tài)或數(shù)量并沒有發(fā)生明顯變化(圖3h)。總之，這些結(jié)果表明脂肪細胞IRE1α可抑制β3-AR激動劑誘導(dǎo)的產(chǎn)熱作用。
4．IRE1α通過PGC1α抑制產(chǎn)熱基因表達
為了進一步探究脂肪組織IRE1α抑制脂肪產(chǎn)熱的分子機制，研究人員對熱中性環(huán)境(30℃)下飼養(yǎng)以及冷刺激(8℃)3天的Ern1fl/fl小鼠和Ern1 AKO小鼠iWAT組織進行RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)在Ern1fl/fl小鼠中，不同溫度下共有4907個基因差異表達，說明這些基因是受溫度調(diào)控的基因。Ern1 AKO小鼠iWAT組織在30℃和8℃下與Ern1fl/fl小鼠相比，分別有876和1075個基因發(fā)生顯著變化。由于脂肪組織IRE1α敲除所影響的生物途徑較多(附圖6a–f)，因此研究人員重點在受溫度調(diào)控基因中探究了IRE1α敲除的影響。研究人員在熱中性或寒冷條件下發(fā)現(xiàn)Ern1 AKO與Ern1fl/fl小鼠相比分別有578和594個差異溫度調(diào)控基因(圖4a)，GO分析顯示在熱中性條件下上調(diào)的免疫和炎癥相關(guān)途徑可能會被Ern1 AKO抑制，而寒冷條件下上調(diào)的脂代謝相關(guān)途徑如FAO可能會被Ern1 AKO進一步增強（小編注：這里作者可能想表達，一般在寒冷條件下炎癥和免疫相關(guān)基因會下調(diào)，即相當(dāng)于在熱中性條件下上調(diào)，在熱中性條件下，IRE1α敲除會下調(diào)這些通路；相反，在寒冷條件下一般會上調(diào)FAO途徑，而在寒冷條件下敲除IRE1α后進一步上調(diào)了FAO途徑。用來說明IRE1α調(diào)控的溫度響應(yīng)基因功能與寒冷誘導(dǎo)的相關(guān)基因功能類似） (圖4b)。值得注意的是，研究人員在受溫度調(diào)控的4907個基因中發(fā)現(xiàn)有543個基因與線粒體功能相關(guān)。在這些受溫度調(diào)控的線粒體基因中，熱中性條件下IRE1α敲除影響了10個基因表達，而在寒冷條件下IRE1α敲除則影響了43個基因表達，在寒冷條件下受IRE1α調(diào)控的基因數(shù)量比熱中性條件下增加了約4倍。而在受溫度調(diào)控的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或溶酶體功能相關(guān)基因中，IRE1α調(diào)控的基因數(shù)量在不同條件下則沒有這么大的差異（小編注：與線粒體功能相關(guān)的543個受溫度調(diào)控的基因中，IRE1α調(diào)控的基因數(shù)量在8℃下比30℃顯著增加了4倍；而與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或溶酶體功能相關(guān)的受溫度調(diào)控的基因中，IRE1α在不同溫度下調(diào)控的基因數(shù)量沒有差異）(圖4c)，表明脂肪組織IRE1α主要調(diào)控寒冷誘導(dǎo)脂肪重塑過程中線粒體代謝相關(guān)功能。隨后，研究人員通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)在寒冷或CL316,243刺激下，iWAT缺失Ern1進一步上調(diào)了產(chǎn)熱相關(guān)基因表達水平(圖4d-e)，表明脂肪細胞IRE1α通過調(diào)控多種代謝途徑，最終抑制iWAT組織中產(chǎn)熱相關(guān)基因的表達。
接下來，為了進一步探究IRE1α調(diào)控產(chǎn)熱相關(guān)基因表達的分子機制，研究人員重點關(guān)注了冷刺激下IRE1α缺失后顯著上調(diào)或下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子和輔轉(zhuǎn)錄因子，其中排名最靠前的是轉(zhuǎn)錄因子PGC1α(圖5a-b)，PGC1α是調(diào)控成熟棕色和米色脂肪細胞中產(chǎn)熱相關(guān)基因表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄輔激活因子。同樣，研究人員還發(fā)現(xiàn)在寒冷或CL316,243刺激下，與Ernfl/fl小鼠相比，Ern1 AKO小鼠iWAT以及iWAT原代細胞中Ppargc1a的基因表達顯著上調(diào)，但Pparg和Prdm16基因表達水平并未發(fā)生明顯變化(圖5c-e)。此外，CL316,243短時間刺激Ern1fl/fl原代脂肪細胞，可顯著促進Xbp1的剪切活性（Xbp1s表達相對于Xbp1t顯著升高），同時顯著下調(diào)了Ppargc1a和Ucp1基因表達水平(圖5f)。而在Ern1 AKO小鼠BAT中，寒冷或CL316,243刺激下Ppargc1a以及產(chǎn)熱相關(guān)基因表達并沒有發(fā)生明顯變化(附圖6g–j)。總之，這些結(jié)果表明IRE1α可通過下調(diào)iWAT中PGC1α表達，從而抑制產(chǎn)熱相關(guān)基因表達。
為了進一步證明IRE1α抑制PGC1α的表達，研究人員利用逆轉(zhuǎn)錄病毒在永生化小鼠iWAT SVF細胞中過表達人源IRE1α和PGC1α，隨后分化為米色脂肪細胞，發(fā)現(xiàn)過表達IRE1α顯著抑制了PGC1α的基因和蛋白表達水平，從而抑制了PGC1α依賴的產(chǎn)熱相關(guān)基因，如Ucp1和Cox7a1(附圖7a–c)。隨后，為了證明在IRE1α缺失的脂肪細胞中，PGC1α是產(chǎn)熱相關(guān)基因表達所必需的，研究人員利用慢病毒敲減永生化Ern1fl/fl和Ern1 AKO iWAT SVF細胞中PGC1α基因，隨后分化為米色脂肪細胞，PGC1α的缺失對SVF細胞的成脂能力并沒有明顯影響(圖5g)，但在CL316,243刺激下，PGC1α的缺失顯著抑制了Ern1 AKO脂肪細胞中Ucp1和Cox7a1的表達水平，且在敲減PGC1α的Ern1fl/fl脂肪細胞中也發(fā)生這一現(xiàn)象(圖5h-i)，表明PGC1a在很大程度上介導(dǎo)了IRE1α缺失的脂肪細胞中產(chǎn)熱相關(guān)基因的表達。
5．IRE1α通過其RIDD活性抑制PGC1α表達
為了進一步探究脂肪細胞IRE1α抑制PGC1α表達的分子機制，研究人員首先探究了IRE1α的RNase活性是否發(fā)揮了作用，研究人員利用4u8C（IRE1α RNase活性的化學(xué)抑制劑）處理原代iWAT脂肪細胞，發(fā)現(xiàn)4u8C可顯著抑制Xbp1s的剪接活性，并上調(diào)CL316,243誘導(dǎo)的Ppargc1a的基因表達以及PGC1α依賴的產(chǎn)熱相關(guān)基因的表達水平(圖6a)。在成熟的米色脂肪細胞以及原代iWAT脂肪細胞中，4u8C處理抑制IRE1α RNase活性后，也顯著抑制了XBP1s剪接活性，并上調(diào)UCP1蛋白的表達水平(圖6b-c)。相反，將永生化的小鼠iWAT SVF細胞分化為成熟米色脂肪細胞，并利用逆轉(zhuǎn)錄病毒分別過表達WT IRE1α或IRE1α-K907A（沒有RNase活性），發(fā)現(xiàn)WT IRE1α的過表達顯著促進了Xbp1s的剪接活性，并下調(diào)了Pgargc1a基因和產(chǎn)熱相關(guān)基因的表達水平以及UCP1蛋白表達水平，同時IRE1α RIDD經(jīng)典靶基因（如Bloc1，Col6a1和Pdgfrb）表達也顯著下調(diào)， 而Pparg和Prdm16的基因表達水平并未發(fā)生變化，且IRE1α-K907A的過表達并沒有這一現(xiàn)象(附圖7d-f)。總之，這些結(jié)果表明，IRE1α通過其RNase活性選擇性抑制脂肪細胞Ppargc1a基因表達，從而下調(diào)PGC1α依賴的產(chǎn)熱相關(guān)基因表達。
IRE1α RNase可通過兩種作用調(diào)控靶基因的基因表達，一是Xbp1s的剪接功能，二是通過RIDD選擇性調(diào)控mRNA降解。因此接下來研究人員進一步探究了IRE1α RNase調(diào)控PGC1α基因表達的作用機制。首先為了檢測XBP1s蛋白是否可以發(fā)揮抑制PGC1α表達的作用，研究人員在成熟米色脂肪細胞中過表達XBP1s蛋白，發(fā)現(xiàn)Ppargc1a和Ucp1的基因表達水平并無明顯變化(圖6d)，表明IRE1α RNase并不是通過XBP1s來抑制PGC1α表達的。有意思的是，通過計算機模擬分析（silico）發(fā)現(xiàn)人源和鼠源Ppargc1a mRNA序列中都存在一個保守的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中含有經(jīng)典的IRE1α剪切位點（CNGCNN）(圖6e)，且重組人源IRE1α蛋白可剪切人源和鼠源WT Ppargc1a mRNA，而4u8C處理可有效抑制IRE1α的剪切作用，此外將Ppargc1a的剪切位點中G突變?yōu)镃后，也可有效抑制IRE1α對Ppargc1a mRNA的剪切作用(圖6f和附圖7g)。然而，重組IRE1α蛋白僅含有IRE1α的細胞質(zhì)激酶/RNase片段（小編注：IRE1α蛋白是一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的跨膜蛋白，具有一個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔隙氨基末端結(jié)構(gòu)域，一個跨膜區(qū)和一個細胞質(zhì)羧基末端結(jié)構(gòu)域。細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域具有蛋白激酶和RNase活性。IRE1α通過其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔隙結(jié)構(gòu)域感知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致IRE1α細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域發(fā)生二聚化和自身磷酸化，從而激活I(lǐng)RE1α的RNase活性。因此，這里重組IRE1α的細胞質(zhì)激酶/RNase片段，相當(dāng)于在脂肪細胞中過表達激活狀態(tài)的IRE1α蛋白，從而探究IRE1α RNase活性對PGC1α的表達調(diào)控作用），其對Xbp1 mRNA的剪切效率遠高于Ppargc1a mRNA（圖6f），這可能與IRE1α過表達后的過度激活狀態(tài)有關(guān)。因此，接下來研究人員進一步研究了內(nèi)源性IRE1α的RIDD活性。首先研究人員從Ern1-Flag3-EGFP敲入小鼠iWAT中分離原代脂肪細胞，并給予CL316,243刺激，發(fā)現(xiàn)IRE1α蛋白對Ppargc1a和Xbp1 mRNA具有相似的剪切效率，而4u8C處理可抑制IRE1α的剪切作用(圖6g)。此外，研究人員利用放線菌素D處理經(jīng)CL316,243刺激的Ern1fl/fl和Ern1 AKO iWAT脂肪細胞，發(fā)現(xiàn)IRE1α缺失或4u8C處理后，Ppargc1a mRNA穩(wěn)定性顯著升高(圖6h)。最后，研究人員利用逆轉(zhuǎn)錄病毒在成熟米色脂肪細胞中共表達IRE1α和PGC1α WT或PGC1α mut（G突變?yōu)镃），發(fā)現(xiàn)過表達IRE1α后，PGC1α WT的基因和蛋白表達顯著下降，以及UCP1蛋白表達明顯下調(diào)；而PGC1α mut的mRNA和蛋白水平并未發(fā)生變化(圖6i，j)。總之，這些數(shù)據(jù)表明IRE1α通過其RIDD活性促進Ppargc1a mRNA的降解（小編注：研究人員在成熟米色脂肪細胞中過表達XBP1s蛋白，發(fā)現(xiàn)Ppargc1a和Ucp1的基因表達水平并無明顯變化(圖6d)，因此排除了XBP1s蛋白對PGC1α表達的影響），從而抑制脂肪細胞中產(chǎn)熱相關(guān)基因表達。
6．米色脂肪細胞IRE1α的缺失可促進白色脂肪棕色化
為了進一步探究脂肪細胞IRE1α抑制PGC1α表達是否可以調(diào)控機體的適應(yīng)性產(chǎn)熱能力，研究人員利用Rosa26mTmG報告小鼠檢測在慢性冷刺激后，UCP1-iCre是否可有效敲除iWAT組織中IRE1α基因，發(fā)現(xiàn)在8℃冷刺激15天后，Ern1 BKO小鼠iWAT中IRE1α表達顯著降低(附圖8a-d)，表明UCP-iCre在慢性冷刺激中可有效敲除iWAT組織中IRE1α。在冷刺激13天時，Ern1 BKO小鼠的耗氧量和產(chǎn)熱量顯著升高，而活動量和RER沒有明顯變化，且iWAT組織發(fā)生顯著棕色化現(xiàn)象。此外，iWAT組織中Ppargc1a和Ucp1表達顯著上調(diào)(附圖8e-l)。BAT組織雖然沒有發(fā)生明顯形態(tài)學(xué)變化，但UCP1的表達水平顯著降低，這一現(xiàn)象與之前研究發(fā)現(xiàn)在棕色脂肪細胞中IRE1α-XBP1s的激活可促進UCP1表達（小編注：參考文獻：Asada R, et al. Sci Rep. 2015 Nov 16;5:16580. 該參考文獻發(fā)現(xiàn)在BAT中，PKA可激活I(lǐng)RE1α-XBP1s途徑，促進UCP1的轉(zhuǎn)錄水平；而誘導(dǎo)BAT發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，來激活I(lǐng)RE1α-XBP1s途徑，并未誘導(dǎo)UCP1的表達，說明在BAT中IRE1α對UCP1的調(diào)控是獨立于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的。而本篇文章發(fā)現(xiàn)在iWAT中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活I(lǐng)RE1α活性，通過抑制PGC1α的轉(zhuǎn)錄表達，抑制UCP1的表達。因此這兩篇文章表明IRE1α在BAT和iWAT組織中對UCP1的調(diào)控作用是相反的）這一結(jié)論一致，然而BAT組織中Ppargc1a mRNA水平并沒有明顯變化 (附圖8m-o)。這表明雖然IRE1α的缺失抑制了BAT組織UCP1的表達，但可以促進iWAT組織產(chǎn)熱相關(guān)基因的表達，并提高機體的能量消耗，說明IRE1α抑制PGC1α依賴的產(chǎn)熱相關(guān)基因表達，在抑制機體適應(yīng)性產(chǎn)熱調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。
7：脂肪細胞中IRE1α的缺失可緩解飲食誘導(dǎo)的肥胖
由于IRE1α-PGC1α軸可能在iWAT組織產(chǎn)熱過程中發(fā)揮著負調(diào)控作用，因此接下來研究人員想要探究過多的能量攝入引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，是否通過激活I(lǐng)RE1α RIDD活性來抑制脂肪組織產(chǎn)熱能力并促進機體代謝紊亂的。首先研究人員分別從HFD（高脂飲食）小鼠和NC（正常飲食）小鼠iWAT中分離原代脂肪細胞，發(fā)現(xiàn)與NC小鼠相比，HFD小鼠iWAT細胞中Xbp1 mRNA剪接活性顯著升高，且IRE1α RIDD經(jīng)典靶基因Bloc1和Col6a1基因表達水平顯著降低，Ppargc1a mRNA水平顯著下降，而Pparg mRNA水平略微下降，Prdm16 mRNA水平未發(fā)生變化（附圖9a-c)。這表明過多的能量攝入引起脂肪細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，可促進IRE1α RIDD活性的過度激活，從而抑制PGC1α的表達，抑制脂肪產(chǎn)熱。
接下來研究人員想要探究抑制脂肪細胞IRE1α是否可以緩解飲食誘導(dǎo)的肥胖。研究人員對Ern1fl/fl小鼠和Ern1 AKO小鼠HFD飲食，發(fā)現(xiàn)飼喂HFD14周后，與Ern1fl/fl小鼠相比，Ern1 AKO小鼠體重、體脂和iWAT、BAT組織重量顯著下降，而小鼠的攝食量和活動量沒有明顯變化(圖7a-b和附圖9d-g)，此外Ern1 AKO小鼠的耗氧量和產(chǎn)熱量顯著增加，RER未發(fā)生明顯變化，表明Ern1 AKO小鼠的能量消耗增加，但糖脂利用比例未發(fā)生變化。同時Ern1 AKO小鼠iWAT組織發(fā)生顯著棕色化現(xiàn)象，UCP1蛋白表達顯著上調(diào)，耗氧率水平升高(圖7a-f和附圖9d-g)；且Ern1 AKO小鼠iWAT脂肪細胞中Ppargc1a以及產(chǎn)熱相關(guān)基因表達顯著升高(圖7g)。這些結(jié)果表明脂肪細胞IRE1α的缺失可促進iWAT產(chǎn)熱，從而有效緩解飲食誘導(dǎo)的肥胖現(xiàn)象。
接下來，研究人員評估了脂肪細胞IRE1α的缺失對小鼠機體葡萄糖代謝和脂肪代謝穩(wěn)態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)在禁食條件下，HFD喂養(yǎng)的Ern1 AKO小鼠血液胰島素水平和血糖水平顯著降低(圖7h-i)，且葡萄糖穩(wěn)態(tài)和胰島素敏感性顯著改善(圖7j-k)；此外，在胰島素刺激下，eWAT、肝臟、骨骼肌中AKT磷酸化水平顯著升高，表明這些代謝組織的胰島素敏感性得到顯著改善(圖7l)；血液中脂聯(lián)素水平顯著升高，高瘦素血癥得到明顯緩解(圖7m)，這表明脂肪代謝穩(wěn)態(tài)得到顯著改善。對eWAT組織的組織化學(xué)分析顯示eWAT組織的冠狀結(jié)構(gòu)和巨噬細胞浸潤顯著減少(附圖9k-l)，流式分析也顯示eWAT組織中CD11b+F4/80+巨噬細胞顯著減少(附圖9m)，促炎基因表達顯著下降(附圖9n)，血液中促炎因子和趨化因子水平顯著降低(圖7n)。總之，這些結(jié)果表明脂肪細胞IRE1α的缺失可促進iWAT組織產(chǎn)熱，從而改善飲食誘導(dǎo)肥胖相關(guān)的代謝紊亂現(xiàn)象，包括緩解脂肪炎癥、改善胰島素敏感性與葡萄糖穩(wěn)態(tài)。
8.IRE1α的缺失可促進β3-AR激動劑的抗肥胖作用
研究證明β3-AR激動劑可提高小鼠機體能量代謝，從而有效抵抗肥胖。然而營養(yǎng)過剩相關(guān)的致胖因子可促進脂肪炎癥，從而損害β3-AR激動劑的抗肥胖作用（小編注：這可能是由于肥胖狀態(tài)下脂肪組織長期的炎癥現(xiàn)象誘導(dǎo)e-JNK-NFκB途徑的激活，導(dǎo)致β3-腎上腺素受體的表達減少，從而對β3-AR激動劑的刺激作用不敏感。參考文獻：Shannon M Reilly, Alan R Saltiel. Nat Rev Endocrinol. 2017）。因此，研究人員檢測了脂肪細胞缺失IRE1α是否可以進一步促進β3-AR激動劑對肥胖的改善效果，給Ernfl/fl和Ern1 AKO小鼠喂養(yǎng)HFD飲食5周后（此時小鼠體重沒有出現(xiàn)差異），每隔一天給小鼠腹腔注射CL316,243，持續(xù)4周(圖8a)，發(fā)現(xiàn)CL316,243治療顯著降低了Ern1 AKO小鼠的體重體脂，并顯著改善機體葡萄糖穩(wěn)態(tài)(圖8b-d)；且iWAT組織發(fā)生顯著棕色化現(xiàn)象(圖8e-f)。此外，長期CL316,243處理下，Ern1 AKO小鼠iWAT組織中Xbp1s的剪接活性顯著降低，且Ppargc1a基因、PGC1α依賴的產(chǎn)熱相關(guān)基因以及FAO相關(guān)基因的表達水平顯著上調(diào)(圖8g-j)。總之，這些結(jié)果表明脂肪細胞IRE1α缺失可進一步促進CL316,243激動劑治療肥胖及其代謝紊亂的作用。
接下來，為了探究利用藥理手段抑制IRE1α RNase活性是否可以緩解飲食誘導(dǎo)的肥胖，研究人員對HFD喂養(yǎng)的Ern1fl/fl小鼠每隔一天注射4u8C治療，連續(xù)4周，發(fā)現(xiàn)4u8C治療的HFD小鼠體重體脂顯著降低，葡萄糖穩(wěn)態(tài)明顯得到改善，脂肪組織重量顯著下降(附圖10a-e)；iWAT組織發(fā)生顯著棕色化現(xiàn)象，且Xbp1s剪接活性顯著下降，Ppaegc1a基因和PGC1α依賴的產(chǎn)熱相關(guān)基因表達顯著上調(diào)(附圖10f-h)，表明藥理抑制IRE1α RNase活性可有效緩解飲食誘導(dǎo)的肥胖。雖然IRE1α RNase抑制劑也可能通過作用于其他組織或脂肪組織中其他類型細胞如巨噬細胞來發(fā)揮其治療肥胖的作用，但這些結(jié)果為IRE1α的藥理抑制劑在抵抗肥胖及其相關(guān)代謝性疾病方面提供了理論依據(jù)。
總結(jié)：
本篇文章發(fā)現(xiàn)在寒冷刺激或β3-AR激動劑刺激下，脂肪組織IRE1α通過抑制iWAT脂解和棕色化來抑制脂肪產(chǎn)熱能力。進一步研究發(fā)現(xiàn)，IRE1α RNase可通過其RIDD活性促進Ppargc1a mRNA降解，從而抑制PGC1α依賴的產(chǎn)熱相關(guān)基因表達。過量的能量攝入會引起脂肪細胞發(fā)生代謝性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而過度激活I(lǐng)RE1α RIDD活性，抑制PGC1α的表達，加劇肥胖的發(fā)生，而藥理抑制IRE1α RNase活性可有效緩解飲食誘導(dǎo)的肥胖，并改善機體葡萄糖穩(wěn)態(tài)和胰島素敏感性。總之，本篇研究結(jié)果證實了脂肪細胞IRE1α在脂肪組織產(chǎn)熱作用中的功能，為靶向抑制IRE1α RNase活性以治療肥胖及相關(guān)代謝性疾病提供了理論支持。
