今天我們通過介紹一篇Cell文章，說一個有意思的現象：SNP位點可同時作為啟動子和增強子，其轉換由基因型決定，結果是一個基因產生不同的RNA，從而參與疾病發生發展。
風險SNP介導的啟動子/增強子轉化通過lncRNA PCAT19促進前列腺癌發生發展，這里我們關注幾個關鍵詞：SNP位點、啟動子、增強子、lncRNA PCAT19和前列腺癌。
增強子的概念在昨天的文章里面介紹過——科研新思路：基因DNA獨立于RNA發揮作用
增強子是能夠增加啟動子活性從而增加基因轉錄頻率的DNA序列。
下面我們直接看文章。
一、SNP位點rs11672691與患者預后及lncRNA PCAT19表達關系
首先前期GWAS分析報道SNP位點rs11672691與前列腺癌風險和患者死亡率相關，接下來研究團隊對CPC-GENE研究中的127位患者的RFS和SNP的基因型進行分析，結果發現GG基因型患者生存率顯著更低：
接下來通過eQTL分析SNP基因型與1-Mbp內基因表達的關系，發現與lncRNA PCAT19最相關：
由于lncRNA PCAT19有多個異構體，其中前列腺癌中表達最高的是兩條lncRNA PCAT19-short和lncRNA PCAT19-long：
注意箭頭處的不同轉錄起始位點TSS。
接下來eQTL分析發現SNP基因型與short和long的相關性正好相反：
G/G型 short表達低；long表達高
這樣就把已經報道的前列腺癌風險位點與lncRNA的不同異構體的表達建立起來了聯系。
二、位于short啟動子的非風險位點更偏重被轉錄因子NKX3.1和YY1結合
首先看一下SNP位點與lncRNA的關系：
紅色箭頭指的是rs11672691和 LD SNP rs887391位點的位置，我們可以看到其位于short啟動子上游和long的（第三）內含子。
而這個位置正好是轉錄因子NKX3.1和YY1的結合區域，且Chip-seq實驗也發現兩個轉錄因子更偏重與非風險序列結合：
圖中紅色箭頭指的是兩個轉錄因子的偏好性，我們可以看到兩個轉錄因子更偏好于結合非風險的序列。
三、SNP位點通過介導啟動子/增強子轉換調控異構體表達
前面已經證明了兩個轉錄因子更偏重結合非風險位點，而非風險基因型與兩條lncRNA異構體的表達關系是：short表達更高，而long表達低。兩個轉錄因子進行的基因沉默也證實了short的表達顯著降低，而long則出現了表達升高：
結果中轉錄因子沉默導致short表達降低可以說明轉錄因子對short啟動子結合介導的轉錄調控；而對long的影響原因是不清楚的。
接下來，通過CRISPRi和CRISPRa分別干預SNP位點（位于short的啟動子區域），結果是long的表達分別降低和升高，而short的表達也是降低和升高：
這里的結果就有意思了：對short來說啟動子的活化表達導致其表達升高，可導致long升高是怎么回事呢？
進一步的，根據Roadmap Epigenomics（前期研究）和Chip-seq的結果，研究團隊發現SNP位點具有啟動子和增強子的組蛋白修飾（H3K4me3和H3K4me1 ）
特性（下圖紅框），因此推測SNP位點通過不同基因型介導啟動子和增強子轉換：
下面就是驗證這個推測了，用到的是熒光素酶報告基因來檢測啟動子和增強子的活性（luciferasebased promoter and enhancer assays），結果發現風險位點有更高的增強子活性，而非風險位點有更高的啟動子活性：
前面我們已經證明了SNP位點所在位置是short的啟動子發揮作用，下面進一步來證明這個位點在的區域作為long的增強子。首先分析了DHS信號 (DNase I hypersensitive, 染色體開放區域的一個指標)與long啟動子的相關性，接下來通過3C實驗（chromosome conformation capture 3C assay）結果發現long 啟動子與SNP位點所在區域有更強作用，且作用富集在SNP位點：
到這里，這篇文章中的一個關鍵問題就解決了：前列腺癌風險位點SNP位點通過不同基因型介導所在區域作為lncRNA PCAT19的啟動子和增強子調控兩者表達，對應關系是：SNP風險位點——long的增強子活性——long高表達；SNP非風險位點——short的啟動子活性——short高表達。
四、lncRNA PCAT19 long通過活化細胞周期基因促進前列腺癌
上面這個問題解決后，下面就是long的的功能和下游機制了。
功能上用了三種敲減技術：siRNA，ASO和shRNA，從體內和體外研究細胞的增殖、侵襲遷移能力：
細胞和動物實驗發現long促進前列腺癌進展
初步機制上，先通過RNA-seq找差異基因，GO分析顯示細胞周期被最顯著富集；接下來TCGA數據分析long表達與細胞周期基因關系、患者預后關系；最后檢測long敲減后周期基因表達：
這一步解決的問題是long發揮作用的下游機制初步探索，明確的是long調控的作用通路（細胞周期）和基因，但沒有解決的是long的直接作用靶點。
具體靶點的確定：首先做long的細胞定位，發現定位與細胞核；接著是long的RNA pulldown+質譜/WB檢測和CHIRP（chromatin isolation by RNA pull-down）驗證，結果發現作用蛋白是HNRNPAB；再通過RIP反向驗證：
HNRNPAB與long直接結合
long通過HNRNPAB發揮作用：HNRNPAB與long直接結合不等于long通過HNRNPAB發揮功能，所以從表型和靶基因調控的類似性說明：
（1）HNRNPAB對前列腺癌的表型影響與long類似；
（2）HNRNPAB與long調控的靶基因類似：
最后是整篇文章作用機制的示意圖：
到這里這篇文章就介紹好了，下面我們來說一個問題：SNP的研究還有沒有創新性？
很多人說SNP的研究已經做了這么多年，沒有創新性了，這個問題要看你怎么考慮。在這篇文章中SNP與lncRNA基因的啟動子和增強子結合起來發的是Cell雜志；如果沒有SNP介導的啟動子/增強子轉換這個部分的工作，就只看這篇文章中lncRNA PCAT19的工作量的話，文章很難超過10分，甚至5分都難。
另外，我們以前推過另外一篇文章：一篇22分的NG教你如何設計課題，這篇文章中SNP也是與lncRNA聯合起來研究的，只不過SNP位點位于lncRNA內部，對lncRNA的影響也是影響到lncRNA的不同作用方式：
所以我個人認為：只有外行才會說一個方向沒有創新性了，不是沒有，是你不知道怎么做。
