1 發熱與免疫系統
發熱是機體通過中樞神經系統和免疫系統協同作用，以調節性體溫升高為特點的一種復雜的生理應激反應，主要由病原體感染（如細菌、病毒、真菌等）或者刺激（如細菌內毒素、炎癥、損傷）引起。當機體受到外源性致熱原侵襲，固有免疫細胞（單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等）細胞膜上Toll樣受體（Toll-likereceptors，TLRs）被激活，從而釋放致熱性細胞因子 [如白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、γ干擾素（IFN-γ）等]，這些致熱性細胞因子不僅調節先天性和獲得性免疫應答，還可直接或間接刺激大腦生成或釋放發熱性介質如前列腺素E2（PGE2）等，引起發熱[11-13]。來源于腦血管內皮細胞的PGE2是炎癥所致發熱過程中重要的中樞性正調節介質，它可通過結合下丘腦視前區（POAH）神經元上EP3受體，觸發交感神經釋放去甲腎上腺素，誘導血管收縮以及棕色脂肪組織產熱增加而引起發熱[14-17]（圖1）。另一種重要的內源性致熱原是腫瘤壞死因子（TNF）。TNF由巨噬細胞、自然殺傷（NK）細胞等分泌，可能通過刺激環氧合酶合成，促進PGE2的生成[18]，從而引起發熱。促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）也可以調節機體發熱過程，其具體作用與和受體結合后誘導細胞內環磷酸腺苷（cAMP）和促腎上腺皮質激素（ACTH）的生成有關[19]。有研究通過脂多糖（LPS）激活垂體促皮質激素細胞中IL-6/STAT3信號通路，發現垂體后葉中IL-6的表達與STAT3、NF-κB、ACTH呈共定位現象，該結果說明IL-6/STAT3參與了ACTH的表達[20]，提示IL-6可以通過調控ACTH的表達來調節機體發熱過程。
TLRs是天然免疫重要的模式識別受體（pattern recognitionreceptor，PRR）[21]，屬于I型跨膜蛋白，在識別病原體感染過程中發揮重要作用。迄今為止，在哺乳動物細胞中共發現至少13種Toll樣蛋白受體[22]，它們主要表達于巨噬細胞和樹突狀細胞。TLRs被LPS激活，進而激活巨噬細胞和誘導樹突狀細胞成熟，分泌細胞因子（如IL-6、IL-1β、IL-10、TNF-α）[23]。研究發現，TLR4與細菌LPS具有高親和力[24]。TLR4位于免疫細胞（巨噬細胞、樹突狀細胞等）表面，MD2是細胞膜上的分泌蛋白，與TLR4胞外區結合形成TLR4-MD2復合物，LPS通過CD14分子和LPS結合蛋白（LBP）轉運與TLR4-MD2復合物結合[25]。一般認為TLR4介導的細胞內信號傳導有2種途徑：髓樣分化因子88（MyD88）途徑和TIR結構域接頭分子（TRIF）途徑[26]。含TIR域的銜接蛋白TIRAP介導MyD88依賴型途徑，Toll受體相關分子TRAM介導TRIF途徑[27]。MyD88是髓樣細胞分化時表達的蛋白，活化的MyD88誘導IL-1受體相關激酶IRAKs磷酸化，進而激活胞漿內的TNF受體相關因子-6（TRAF-6），活化后的TRAF-6通過轉化生長因子-β激酶（TAK）與IκB激酶（IKK）信號級聯，使核轉錄因子-κB（NF-κB）抑制蛋白（IκB）磷酸化而降解，產生游離NF-κB，進入細胞核誘導多種炎癥因子基因轉錄，如TNF-α、IL-1、IL-6等。TRIF途徑是由TRIF直
接招募激活TRAF-6，活化的TRAF-6可直接激活IKKs或TAK，再通過磷酸化的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）激酶（MKK）和IKKs，激活NF-κB和MAPK信號通路，釋放炎性細胞因子，最終導致機體發熱（圖1）。
2 人參增強免疫力的作用機制
2.1 人參與固有免疫細胞
巨噬細胞可以清除體內衰老、損傷、凋亡的細胞和免疫復合物以及病原體等，激活固有免疫系統。研究表明人參皂苷能夠明顯促進促炎細胞因子的產生，原因與增強巨噬細胞TLR4表達進而增加小鼠巨噬細胞的吞噬活性有關[30]。人參寡糖也能顯著增加巨噬細胞吞噬能力，促進NO、TNF-α和活性氧（ROS）產生，并且它通過上調一氧化氮合成酶的活性刺激NO生成[31]。同時有研究用體外實驗探討韓國紅參多糖對巨噬細胞活化作用的分子機制，研究結果顯示人參多糖能誘導NO生成和提高誘導型一氧化氮合成酶（iNOS）、NF-κB、激活蛋白1（AP-1）、信號轉導和轉錄激活因子1（STAT-1）等mRNA水平，提示紅參多糖可能通過增強TLR2表達，活化NF-κB以及上游信號轉導酶（如ERK和JNK），從而激活巨噬細胞[32]。綜上，人參可能通過激活TLR4或TLR2來激活巨噬細胞，從而激活固有免疫系統。
NK細胞是一種先天免疫系統的細胞毒性淋巴細胞，參與第一道屏障，防御新產生的惡性細胞和被感染的細胞。有研究指出人參的水提物和醇提物均可顯著提高正常成年小鼠胸腺指數和脾臟指數，提高NK細胞對L929細胞的殺傷率[33]。人參皂苷Rb1拮抗肝癌細胞抑制NK細胞免疫功能的實驗表明，人參皂苷Rb1具有提高NK細胞殺傷腫瘤細胞的能力[34]。有研究指出從人參根提取的低聚糖可以提高肝癌小鼠NK細胞活性[35]，人參皂苷Rg1也可以激活小鼠脾臟NK細胞活性[36]。
樹突狀細胞（DC）是免疫系統最有效的抗原呈遞細胞，通過TLR識別病原體，是連接先天和適應性免疫應答之間的橋梁[37]。研究顯示人參皂苷Rg3可誘導外周血來源的DC成熟，促進其功能轉變，并呈劑量依賴性[38]。同時人參皂苷Rg3聯合細胞因子可以將正常人單核細胞體外誘導成形態、表型和功能符合DC特征的細胞，可使單核細胞誘導DC產率增加，并提高其抗原呈遞功能[39]。因此，人參可以通過促進DC細胞產生、成熟和提高抗原呈遞能力來激活免疫系統。
2.2 人參與固有免疫分子
人參不僅作用于固有免疫細胞，對固有免疫分子的產生也有影響。固有免疫分子主要由細胞因子、補體、CD分子等組成。研究發現人參皂苷Rg1和人參皂苷Re均能促進小鼠淋巴細胞增殖水平及提高IL-4、IL-19、IL-12和IFN-γ水平[40]，作用機制可能與干擾LPS與TLR4受體的結合來發揮免疫調節作用有關[41]。同時研究發現人參皂苷Rg1也可以提高補體C3和C4的水平[42]。在體外實驗中發現人參提取物酸性多糖可以提高細胞因子（IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α）mRNA水平[43]。在免疫應答中，細胞因子如IL-2、IL-12、IL-18、TNF-α等，也可以通過影響NK細胞的分化、成熟、增殖和活化來調控其免疫學功能，進而調節免疫應答[44-46]。綜上所述，人參可通過調控細胞因子的生成與釋放，間接調控免疫系統。
3 應用網絡藥理學預測人參解熱作用機制
中藥網絡藥理學的研究思路有2種：一是根據公共數據庫對中藥活性成分信息、藥效及藥理作用等進行文本挖掘，預測藥物作用靶點和疾病對應的治療靶標，并從生物網絡平衡的角度解析藥物作用機制；二是利用各種組學技術、高內涵和高通量技疾病”網絡，建立預測模型，進而解析所研究藥物的網絡藥理學機制[47]。本文通過文本挖掘預測人參解熱作用機制，其具體步驟見圖2。
3.1 藥物-疾病-靶標數據收集及篩選
中藥成分數據庫包含中藥藥方、中藥材、藥材成分和化合物潛在靶標等信息，常用的中藥成分數據庫有TCMID、TCMDatabase@Taiwan、TCMSP和TCMIP等[48]。其中TCMSP數據庫包含了《中國藥典》收錄的499種中藥，以及從PubChem等數據庫收集與草藥相關的29 384個化學成分及其詳細的藥動學信息[49]。TCMSP數據庫也是一個全面研究中藥的分析平臺，可以用于有效成分鑒定、藥物靶點篩選和化合物靶標-疾病網絡構建[50-52]。Liu等[53]利用TCMSP數據庫，整合口服生物利用度（oralbioavailability，OB）篩選（≥40%）、藥物相似性評估（≥0.18）等信息來鑒定甘草生物活性成分及其潛在靶標，其從甘草中鑒定了73種生物活性成分，并發現91個潛在的靶標。
根據TCMSP數據庫用戶指南，按照OB≥30%、藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18的篩選條件對人參化學成分和人參腸道代謝物 [原人參二醇（PPD）、原人參三醇（PPT）、CK等]，以及其相關靶標進行篩選，共篩選出人參22種活性成分（圖3）和可能的靶標蛋白。再由HPO數據庫檢索得到編號為HP 0002373的發熱相關靶標。
3.2 “人參-靶標-發熱”網絡構建與機制預測
檢索得到人參活性成分靶標和發熱相關靶標后需要對二者相互作用關系進行關聯，STRING數據庫常用于構建“蛋白-蛋白”相互作用網絡[54]。通過STRING數據庫構建“人參-靶標-發熱”網絡，再由Cytoscape軟件將“人參-靶標-發熱”網絡進行可視化（圖4）。此網絡由49個節點（表示蛋白質）和126條線（表示蛋白與蛋白相互作用）組成，圓形節點代表人參活性成分預測靶標，六邊形節點代表發熱相關靶標。節點連接度、節點緊密度和節點
介度3個拓撲特征指標用于評價節點網絡中心性。圖4中的節點大小與節點連接度有關，節點連接度數值越大，則代表節點的圖形面積越大。
“人參-靶標-發熱”網絡構建后，利用Cytoscape軟件篩選出網絡中關鍵節點，再通過GATHER測算關鍵節點潛在的分子機制。GATHER是常用的基因功能富集分析平臺，包含KEGG通路分析等[55]。首先在Cytoscape軟件中設置節點連接度、節點緊密度和節點介度的值，使其值大于網絡中所有節點相應特征值的中位數，找到“人參-靶標-發熱”網絡中的18個關鍵節點（表1）。通過GATHER平臺對18個關鍵節點進行KEGG通路分析，測算出其主要可能的信號通路和靶點（表2）。
4 人參作用TLR信號通路促白虎湯解熱作用
GATHER平臺針對“人參-靶標-發熱”網絡中的18個關鍵節點進行了基因功能富集分析，得到了9條信號通路。TLR在介導免疫與機體發熱中發揮重要作用。有研究用內毒素及啤酒酵母誘導的發熱模型對人參皂苷Rg3進行了抗炎及解熱作用的研究，結果表明人參皂苷Rg3具有一定的發汗、抗炎及解熱作用[56]。因此，結合網絡藥理學，本文測算出人參促白虎湯解熱作用機制可能與人參作用于MyD88依賴型/MyD88非依賴型TLR信號通路激活免疫系統有關。
人參可調控TLR的表達來調節機體炎癥和免疫反應，達到解熱作用。研究發現人參皂苷Rb1可抑制病毒誘導的氧化應激致小鼠急性肺損傷反應過程中TLR4蛋白及TLR4mRNA的表達[57]。Nakaya等[58]通過體內外實驗證明，人參可通過TLR誘導前炎性細胞活素的生成，如TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ。已有研究通過人參皂苷Rg1作用LPS刺激的小鼠巨噬細胞株RAW 264.7細胞，觀察其對TLR信號通路的影響，發現人參皂苷Rgl對LPS刺激的TLR4及其下游通路的MyD88和TRAF 6有抑制作用[59]。
已有研究報道白虎湯解熱作用機制可能與升高人體的血鈣濃度有關，而鈣離子可抑制產熱中樞、渴感中樞和出汗中樞，達到解除煩渴的效果[60-61]，也有研究認為其解熱作用可能與方中石膏所含的微量物質和知母中的芒果苷有關[62-63]。因此，在人參白虎湯中人參可能是通過作用于TLR信號通路激活機體免疫系統而發揮益氣生津、甘溫除熱功效，從而促其解熱；也有可能與人參白虎湯中其他成分的協同作用有關。
5 展望
中藥復方是中醫臨床應用的主要形式。中藥復方和生物體均為復雜體系，欲探索二者相互作用的科學內涵，必將涉及海量信息的處理。網絡藥理學以系統生物學理論為基礎，應用了高通量組學數據分析、網絡數據庫檢索及計算機虛擬計算等，特別適用于中藥復方研究。本文應用網絡藥理學研究方法，通過對人參主要成分靶點和發熱對應靶標的數據挖掘，構建“人參-靶標-發熱”網絡，并預測人參是通過作用于TLRs信號通路激活機體天然免疫系統來發揮促白虎湯解熱功效，后期擬通過進一步實驗加以驗證，以期為扶正藥促解熱作用研究提供實驗數據。
參考文獻（略）
來 源：李 賽，朱晨晨，田雪飛，彭 蘭，張序晴，曾 嶸，王志琪. 應用網絡藥理學探討人參促白虎湯解熱作用的免疫學機制 [J]. 中草藥, 2018, 49(10):2460-2468.
