糖尿病是一類以高血糖癥為特征的代謝紊亂疾病。經常和長期存在的高血糖癥可導致許多微血管并發癥，包括糖尿病視網膜病變（DR），糖尿病腎病，糖尿病神經病變和糖尿病足病。高血糖癥損傷的早期和主要靶點是視網膜脈管系統。最初糖尿病視網膜病變的特點表現為以下幾種形態學變化，包括周細胞減少，基底膜增厚，血管通透性增加，血管閉塞和血管閉塞微動脈瘤。視網膜血管細胞主要包括周細胞和內皮細胞（ECs）。糖尿病患者和動物發生糖尿病性視網膜病變，其早期的病理特征是周細胞丟失。視網膜ECs的表型經歷從正常的靜止表型轉變為凋亡和活躍的表型。視網膜EC功能障礙可導致血管滲透性，黃斑水腫和血管生成增加。正常的周細胞—內皮細胞“對話”對視網膜脈管系統的發育和穩態維持來說是非常重要的。異常的周細胞—內皮細胞“對話”則可導致視網膜血管滲漏，閉塞和新血管的形成。因此，基于調節周細胞—內皮細胞“對話”的治療干預手段將預防和保護糖尿病引起的視網膜血管損傷。
來自復旦大學上海醫學院附屬耳鼻喉眼科醫院的顏標研究團隊最近于PNAS期刊（IF=9.504）上在線發表了題為“Targeting pericyte-endothelial cell crosstalk by circular RNA-cPWWP2A inhibition aggravates diabetes-induced microvascular dysfunction”的研究，該研究顯示糖尿病應激上調視網膜周細胞，而不是內皮細胞中cPWWP2A的表達水平。體外研究表明，cPWWP2A充當內源性miR-579的海綿，調控Angiopoietin 1/Occludin/SIRT1基因的表達，直接調節周細胞生物學功能，而通過攜帶cPWWP2A的外泌體間接調節ECs生物學功能，促進ECs的遷移和血管形成能力。體內研究表明，cPWWP2A過表達或抑制miR-579表達可減輕糖尿病引起的視網膜血管功能障礙。 相反，抑制cPWWP2A表達或過表達miR-579會加重視網膜血管功能障礙。這項研究揭示了周細胞和ECs “對話”的新機制，干預cPWWP2A或miR-579的表達可為治療糖尿病微血管并發癥提供治療策略。
1. circRNA表達譜分析鑒定cPWWP2A可作為糖尿病視網膜病變的潛在調控分子
作者主要分析db/db糖尿病小鼠模型和非糖尿病小鼠的視網膜中的circRNA表達譜，其中433種上調，411種下調，再通過對比circRNA數據庫，選擇與circBase庫記錄吻合的circRNAs,從中隨機篩選并qRTPCR驗證，發現20種上調和下調水平最明顯的circRNAs。在上調最明顯的三種mmu_circ_0010536, mmu_circ_0004367和 mmu_circ_0000254，其中小鼠mmu_circ_0000254（cPWWP2A）與人同源的hsa_circ_0074837的相似性高達89%。Sanger測序和RNase R消化實驗鑒定cPWWP2A屬于來源于PWWP2A基因的環狀RNA。鏈脲霉素誘發小鼠糖尿病后或者在db/db小鼠，其視網膜中cPWWP2A表達水平明顯上調，而胰島素治療可以明顯抑制cPWWP2A表達。而且糖尿病患者的纖維血管膜中的cPWWP2A表達水平也明顯上調。
2. cPWWP2A與體內糖尿病誘導的視網膜血管功能障礙有關
免疫熒光染色（綠色代表血管，紅色代表周細胞）證明敲低cPWWP2A表達可以明顯降低視網膜血管中周細胞的覆蓋水平；Evans blue實驗證明與糖尿病小鼠的視網膜相比，敲低cPWWP2A表達會明顯加重糖尿病引起視網膜的血管滲漏；糖尿病視網膜的重要特征包括周細胞丟失、小動脈瘤和非細胞組成的微血管。胰蛋白酶消化視網膜血管實驗發現，敲低cPWWP2A表達進一步增加了糖尿病視網膜的中非細胞組成的血管、周細胞丟失和微動脈瘤的數量；ELISAs實驗證明敲低cPWWP2A表達還會促進炎癥因子IL-2, IL6, TNF-α, VEGF和MCP-1的分泌，加重糖尿病誘導的視網膜炎癥反應。但是如果過表達cPWWP2A則出現相反的結果，起到保護周細胞免受糖尿病誘導視網膜損傷的作用。
3. cPWWP2A在體外調控視網膜周細胞功能及其與內皮細胞的“對話”
視網膜血管細胞主要包括周細胞和內皮細胞兩種，與糖尿病相關的應激（如高糖、氧化應激和炎癥刺激），顯著上調了周細胞中cPWWP2A的表達，但未改變內皮細胞中cPWWP2A的表達水平。由于高血糖對視網膜血管損傷的影響，周細胞丟失是早期糖尿病視網膜病變的一個標志。體外實驗中，周細胞暴露于高糖環境中，可以模擬體內糖尿病環境。PI染色和caspase 3/7活性測定實驗表明，敲低cPWWP2A表達促進了高糖應激誘導的周細胞凋亡。
增生性糖尿病視網膜病變通常包括有害性的視網膜血管生成。正常的周細胞功能和周細胞—內皮細胞間的 “對話”對視網膜血管的穩定性和新生血管系統的成熟具有重要意義。敲低cPWWP2A表達可抑制周皮細胞標記物（(PDGF)-β, α-SMA, Desmin,和 NG2）的表達，抑制周細胞的增殖。在周細胞和人視網膜血管內皮細胞(HRVECs)共培養模型中，敲低cPWWP2A表達抑制了HRVECs募集周細胞的現象。同時在周細胞中敲低cPWWP2A表達也顯著增加了內皮對大分子的通透性。
4. cPWWP2A調節周細胞功能的具體機制是什么？
因為cPWWP2A主要分布在周細胞的胞漿，所以作者猜測cPWWP2A可能作為miRNA的海綿，調控基因表達。Ago2蛋白是RNA誘導的沉默復合物(RISC)的核心成分，它將miRNA復合物與靶mRNAs結合。RIP實驗證明Ago2抗體可以特異性捕獲到內源性cPWWP2A；結合TargetScan預測的靶miRNAs，通過luciferase reporter實驗篩選到只有miR-579可明顯抑制其熒光素酶活性；同時miR-579與cPWWP2A存在共定位的現象，兩者也存在多個結合位點。所以cPWWP2A很有可能作為miR-579的海綿，調節周細胞功能。
5. cPWWP2A作為miR-579的海綿，下游靶向什么基因，調節周細胞功能？
生信分析預測了angiopoietin1/occludin/SIRT1三個基因可能是miR-579的下游靶基因。Luciferase reporter實驗證明miR-579與這三種靶基因的潛在相互作用。體外敲低cPWWP2A表達可以明顯抑制angiopoietin1/occludin/SIRT1三個基因的表達水平；過表達miR-579進一步加重高糖應激誘導的周細胞凋亡，抑制周細胞標志物（PDGF-β, α-SMA, Desmin, 和 NG2）的表達，抑制周細胞的增殖，抑制HRVECs對周細胞的招募。而過表達cPWWP2A則會部分逆轉miR-579過表達介導的這些效應。
6. 在體內cPWWP2A–miR-579–Angiopoietin 1/Occludin/SIRT1軸對于視網膜血管功能障礙的影響？
應用miR-579激動劑或者敲低cPWWP2A表達都可明顯抑制小鼠視網膜中Angiopoietin 1/Occludin/SIRT1基因的表達。應用miR-579激動劑明顯降低視網膜血管中周細胞的覆蓋水平，增加糖尿病小鼠視網膜的中非細胞組成的血管、周細胞丟失和微動脈瘤的數量，明顯加重糖尿病引起視網膜的血管滲漏。而應用miR-579拮抗劑則獲得與之相反的結果。之前的結果已經證明敲低cPWWP2A表達可造成視網膜血管功能障礙，而當同時注射外源性miR-579拮抗劑則會抵消這血管功能障礙的負面效應。
7. 周細胞中的cPWWP2A通過什么機制影響ECs的功能和調節兩者間的“對話”？
相比與非糖尿病視網膜，來源于糖尿病視網膜的周細胞和ECs中的cPWWP2A表達水平明顯上調。在體外，高糖應激只會誘導周細胞，而不是ECs的cPWWP2A表達上調，提示cPWWP2A可能通過旁分泌途徑進入ECs。原位雜交和熒光染色實驗證明在非糖尿病視網膜的周細胞和ECs中都表達cPWWP2A，而在糖尿病視網膜中，周細胞數量減少，cPWWP2A主要在ECs中表達。有趣的是，作者發現高糖應激可以促進周細胞分泌cPWWP2A到培養基上清中，用這種上清培養ECs可促進ECs的遷移和血管形成能力。而且相比非糖尿病小鼠，糖尿病小鼠的血漿中cPWWP2A的表達水平明顯上調。應用蛋白酶K, 而不是DNase I或者RNase A，降低周細胞培養基中cPWWP2A的表達水平。
胞外囊泡可能來源于凋亡小體或者細胞不斷分泌的外泌體。應用外泌體分泌抑制劑—GW4869，而不是凋亡抑制劑ZVAD有效抑制從周細胞轉移到ECs的 cPWWP2A的水平，提示可能是外泌體介導cPWWP2A的細胞間轉移。為了排除ECs自身cPWWP2A表達的影響，高糖處理周細胞后的上清可以顯著提高cPWWP2A?/? ECs的增殖、遷移和血管形成能力。但當同時加入cPWWP2A反義轉錄本，可以抵消促進ECs遷移和血管形成能力的效應，進一步提示周細胞分泌到上清中cPWWP2A的重要性。
參考文獻
Liu C, Ge HM, Liu BH, et al. Targeting pericyte-endothelial cell crosstalk by circular RNA-cPWWP2A inhibition aggravates diabetes-induced microvascular dysfunction. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019 Mar 26. pii: 201814874. doi: 10.1073/pnas.1814874116.
