▎藥明康德編譯整理（Nature Reviews Drug Discovery）
慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染在全球范圍內(nèi)是導(dǎo)致肝臟疾病的常見原因，在東南亞地區(qū)疾病負(fù)擔(dān)尤其嚴(yán)重。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估計(jì)，全球有大約2.57億HBV感染患者。目前，疫苗、核苷或核苷酸（NUC）類藥物不但能夠降低新感染率（new infection rates），而且對于堅(jiān)持長期病毒抑制療法的HBV患者來說，能夠延緩肝病的進(jìn)展。然而科學(xué)和醫(yī)學(xué)界并不滿足于現(xiàn)狀，他們已經(jīng)開始共同努力，開發(fā)旨在治愈這一感染的創(chuàng)新抗病毒藥物和免疫學(xué)療法。近日Nature Reviews Drug Discovery上的一篇綜述對目前治療HBV感染的研發(fā)策略進(jìn)行了全面的盤點(diǎn)。藥明康德內(nèi)容團(tuán)隊(duì)今天將與讀者分享這一綜述的精彩內(nèi)容。共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）HBV能夠在被感染細(xì)胞的細(xì)胞核中生成cccDNA和整合序列。這些序列是病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄模板。cccDNA是生成前基因組RNA（pgRNA）的模板。pgRNA提供了逆轉(zhuǎn)錄和病毒基因組復(fù)制所需的模板。cccDNA是一個(gè)病毒微型染色體（minichromosome），它是導(dǎo)致病毒在受到感染的細(xì)胞中長期存在的原因。它的半衰期非常長，目前的標(biāo)準(zhǔn)療法不能有效清除cccDNA。▲cccDNA的表觀遺傳學(xué)調(diào)控（圖片來源：參考資料[2]）
HBV具有的一些重要免疫學(xué)特征讓它們能夠長期存在并且不易清除。HBV在肝細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制不會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的先天免疫系統(tǒng)察覺。HBV能夠生成和分泌大量病毒抗原，逐漸改變和耗竭HBV特異性T細(xì)胞和B細(xì)胞的功能。即便使用目前的標(biāo)準(zhǔn)療法，免疫反應(yīng)的缺陷導(dǎo)致患者很難將HBV特異性免疫力恢復(fù)到正常水平，因而無法有效控制感染。HBV的基因組是長為3.2kb的松弛環(huán)狀DNA（rcDNA）基因組。它與聚合酶一起包裝在病毒衣殼中，外面覆蓋著包膜蛋白（HBsAgs）。HBV的生命周期可以分為以下幾步：- HBV通過與肝細(xì)胞表面的NTCP受體相結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞，而后，病毒脫去包膜蛋白，衣殼進(jìn)入細(xì)胞核，釋放環(huán)狀DNA。宿主的DNA修復(fù)機(jī)制會(huì)將這些外源DNA轉(zhuǎn)換成cccDNA。它們與宿主的組蛋白和其它蛋白一起包裝成微型染色體。這種微型染色體是肝細(xì)胞核中長期存在的病毒基因組儲備庫，它的數(shù)量可以通過感染新肝細(xì)胞和細(xì)胞間核衣殼的回收而不斷增加。
- cccDNA是生成pgRNA的模板，它需要肝炎X蛋白（HBx）才能維持正常表達(dá)。cccDNA轉(zhuǎn)錄生成6種RNA，其中包括與HBV聚合酶結(jié)合的pgRNA。
- 與pgRNA 結(jié)合的聚合酶通過與核蛋白和P蛋白構(gòu)成的6聚體結(jié)合，啟動(dòng)核衣殼的組裝。
- prgRNA在未成熟的核衣殼內(nèi)引導(dǎo)松弛環(huán)狀DNA的合成，生成成熟的核衣殼。
- 成熟核衣殼如果與HBsAg相結(jié)合，會(huì)引發(fā)病毒獲得包膜蛋白，并且被釋放到細(xì)胞外。
▲HBV的生命周期（圖片來源：參考資料[2]）
目前，多種創(chuàng)新療法可以靶向HBV生命周期中的這些步驟，達(dá)到降低病毒負(fù)荷的目的。病毒的不斷復(fù)制和釋放會(huì)導(dǎo)致新的肝細(xì)胞被感染，從而維持慢性感染和cccDNA庫的穩(wěn)定。在大多數(shù)患者中，NUC療法無法完全抑制病毒產(chǎn)生。因此，將病毒進(jìn)入抑制劑與復(fù)制抑制劑聯(lián)用是減少cccDNA庫的有力手段。防止病毒進(jìn)入細(xì)胞的方法包括開發(fā)從HBsAg中衍生的多肽。它可以通過與NTCP受體結(jié)合，阻礙HBV病毒進(jìn)入細(xì)胞。例如Myrcludex B（又名bulevirtide），這款多肽作為單藥療法，能夠在48周之后，將HDV的RNA水平降低2.84 log。它與干擾素聯(lián)用的效果更好。除了多肽以外，小分子藥物（例如ezetimibe和環(huán)孢素衍生物）和靶向HBsAg的單克隆抗體也在研究中被用于阻斷HBV進(jìn)入細(xì)胞。抑制cccDNA的生成是一個(gè)有吸引力的策略。然而，我們需要對cccDNA合成的過程具備更全面的了解，才能靶向這一過程。因?yàn)閏ccDNA生成過程中的很多關(guān)鍵步驟需要宿主細(xì)胞核中的蛋白酶，微型染色體的形成也需要宿主的組蛋白和其它蛋白。抑制cccDNA生成的療法可能會(huì)靶向宿主蛋白，它們可能比靶向病毒蛋白的療法具有更多的毒副作用。鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases）可以被用來直接靶向cccDNA，這一策略在細(xì)胞培養(yǎng)模型中已經(jīng)能夠成功編輯HBV的cccDNA。基于CRISPR-Cas9的治療方法可以在cccDNA中加入突變或者缺失，導(dǎo)致cccDNA失活。臨床前研究表明，超過90%的HBV DNA可以被Cas9切割。然而，大約7%的cccDNA基因組在經(jīng)過CRISPR-Cas9介導(dǎo)的切割之后，能夠被修復(fù)成不影響cccDNA功能的狀態(tài)。因此，這一策略需要引入靶向cccDNA中不同位點(diǎn)的多個(gè)指導(dǎo)RNA（gRNA），確保cccDNA的失活。基因編輯療法的繼續(xù)開發(fā)需要解決肝細(xì)胞遞送、脫靶效應(yīng)等挑戰(zhàn)，然而，目前這是唯一一種在組織中讓cccDNA永久性失活的方法。高病毒抗原負(fù)荷被認(rèn)為在維持慢性感染中起到重要作用，因此，通過沉默cccDNA的轉(zhuǎn)錄或者降解病毒RNA來降低病毒抗原的表達(dá)水平也獲得研究人員的關(guān)注。基于核苷酸的抗HBV療法使用RNA干擾或反義寡核苷酸（ASO）來降低HBV mRNA的水平。業(yè)界的普遍觀點(diǎn)是靶向HBV mRNA是治愈性療法的重要組成部分。它可以限制HBsAg的表達(dá)，從而幫助HBV特異性免疫力的恢復(fù)。這一技術(shù)平臺的另一個(gè)特點(diǎn)是可以通過對靶點(diǎn)序列的篩選，設(shè)計(jì)出同時(shí)靶向多種HBV mRNA的療法。▲RNAi療法靶向病毒mRNA的示意圖（圖片來源：參考資料[3]）
Arrowhead公司開發(fā)的RNAi療法ARC-520在臨床試驗(yàn)中的表現(xiàn)展現(xiàn)了這類療法的潛力。如今的第二代HBV RNAi療法已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出可喜的療效。例如JNJ3989（ARO-HBV）能夠?qū)BsAg蛋白水平平均降低1.7-2.0 log。在治愈性潛力方面，我們目前還不了解需要將HBsAg水平降到多低，維持多久，才能夠?qū)е翲BV特異性免疫力的恢復(fù)。目前正在進(jìn)行的2期臨床試驗(yàn)可能為回答這些問題提供洞見。可能在降低HBsAg水平之后，我們需要另一種免疫刺激手段來完全發(fā)揮抗病毒免疫反應(yīng)的潛力。將衣殼組裝抑制劑與NUC聯(lián)用可能進(jìn)一步降低病毒水平，從而在慢性乙肝患者中提高HBV特異性免疫反應(yīng)的恢復(fù)。目前抑制衣殼組裝的小分子藥物可以分為兩類：核蛋白異構(gòu)調(diào)節(jié)劑（CpAMs）可以導(dǎo)致非衣殼核蛋白多聚體的組裝錯(cuò)誤（例如GLS4和RO7049389）；衣殼組裝調(diào)節(jié)劑可以讓衣殼正常組裝，但是不包含病毒核苷酸（例如AT-130， NVR-3778， JNJ6379等）。這兩類抑制劑不但可以減少病毒顆粒的釋放，而且可以阻斷核衣殼向細(xì)胞核的運(yùn)輸，從而降低cccDNA的形成。在短期臨床試驗(yàn)中（小于12個(gè)月），衣殼組裝抑制劑能夠降低HBV的DNA和RNA水平。例如，在施藥期結(jié)束之后，NVR-3778能夠讓HBV的DNA水平降低1.72 log，JNJ6379的表現(xiàn)為2.16-2.89 log。核酸聚合物（nucleic acid polymers, NAPs）由于其兩性聚合物（amphipathic polymers）的特性，可以產(chǎn)生抗病毒作用。它們對HBV感染的特殊作用在于能夠抑制受到感染的肝細(xì)胞釋放HBsAg。近來的臨床試驗(yàn)表明，Replicor公司開發(fā)的REP2139（一種核酸聚合物），和富馬酸替諾福韋二吡呋酯（TDF）和聚乙二醇化干擾素α2a（peg-IFN）聯(lián)用，能夠達(dá)到對80%的HBV感染患者的“功能性控制”。協(xié)同激活人體的抗病毒免疫力可能導(dǎo)致HBV的功能性治愈。HBV受到控制的患者表現(xiàn)出協(xié)調(diào)的HBV特異性激素和細(xì)胞免疫反應(yīng)。他們針對不同的病毒抗原產(chǎn)生強(qiáng)勁的T細(xì)胞反應(yīng)，并且B細(xì)胞能夠分泌抗HBV抗體。因此，激活免疫機(jī)制讓人體自發(fā)清除HBV感染，可能成為治療慢性HBV感染的一種治療手段。靶向先天免疫力的療法主要利用細(xì)胞因子（TNF，IFNα，IFNγ和IL-1β）的抗病毒效應(yīng)，它們同時(shí)能夠誘發(fā)適應(yīng)性免疫力。IFNα就是基于這一原理。IFNα療法能夠在5-10%的慢性乙肝患者中達(dá)到功能性治愈。這一療法的作用機(jī)理在于IFNα不但具有直接抗病毒效果，而且可以提高自然殺傷（NK）細(xì)胞的反應(yīng)。而且，接受IFNα治療后達(dá)到HBsAg陰性的患者恢復(fù)了HBV特異性T細(xì)胞反應(yīng)。抗病毒細(xì)胞因子還有可能清除cccDNA，這是治愈慢性乙肝患者最直接和有效的方法。體外研究表明，IFNα或淋巴毒素-β（lymphotoxin-β）可能誘發(fā)對病毒DNA的APOBEC依賴性脫氨基作用。這可能降低受到感染的肝細(xì)胞中的cccDNA水平。在慢性乙肝患者中激活先天免疫力還可以通過Toll樣受體（TLR）或RIG-I激動(dòng)劑來實(shí)現(xiàn)。RIG-I激動(dòng)劑能夠在肝細(xì)胞中直接激活先天免疫力，而TLR7或TLR8激動(dòng)劑能夠激活肝細(xì)胞周圍的免疫細(xì)胞。名為inarigivir的RIG-I激動(dòng)劑同時(shí)具有直接抗病毒效應(yīng)。在臨床試驗(yàn)中，它能夠劑量依賴性降低HBV的DNA和RNA水平，而且26%的患者HBsAg水平出現(xiàn)下降。TLR7激動(dòng)劑GS-9620能夠在漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（plasmacytoid dendritic cells）中激活I(lǐng)FNα的生成。TLR8激動(dòng)劑能夠強(qiáng)力激活肝內(nèi)單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞生成和分泌IL-12和IL-18。而IL-12和IL-18會(huì)激發(fā)IFNα的生成，而且IL-12可以部分恢復(fù)耗竭HBV特異性T細(xì)胞的活性。HBV特異性免疫反應(yīng)在慢性乙肝患者中出現(xiàn)缺陷。理論上這一缺陷可以通過免疫檢查點(diǎn)抑制劑（例如抗PD-1或抗CTLA-4療法）或治療性疫苗來解決。抗PD-1療法在慢性乙肝患者中顯示出一致但是有限的抗病毒活性，然而研究人員仍然需要確定篩選患者的標(biāo)準(zhǔn)和抗PD-1療法的最佳劑量。治療性疫苗目前尚未取得顯著療效。這些免疫療法療效不佳的原因可能與慢性乙肝患者的抗HBV免疫反應(yīng)相關(guān)。在慢性患者中，HBV特異性T細(xì)胞非常稀少，而且顯示出耗竭表型。而且，阻斷PD-1信號通路可能要與其它細(xì)胞因子療法聯(lián)用才能夠讓HBV特異性B細(xì)胞恢復(fù)活性。利用基因工程，生成靶向HBV的TCR-T細(xì)胞療法或者CAR-T療法可以幫助克服這一障礙。這類療法在體外和動(dòng)物試驗(yàn)中能夠識別HBV感染的靶標(biāo)。然而，因?yàn)橹圃霻細(xì)胞療法的過程非常復(fù)雜，這限制了臨床試驗(yàn)的進(jìn)展。業(yè)界逐漸達(dá)成的共識是：我們需要具有創(chuàng)新作用機(jī)制的組合療法才能達(dá)到功能性治愈的目標(biāo)。這些療法需要達(dá)到以下目標(biāo)：完全抑制病毒生產(chǎn)和從頭感染（de novo infection）；完全抑制HBsAg的產(chǎn)生；適當(dāng)激活免疫系統(tǒng)，提高HBV特異性適應(yīng)性免疫反應(yīng)；在肝臟中安全控制免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。在設(shè)計(jì)檢驗(yàn)組合療法的臨床試驗(yàn)時(shí)，我們需要具有堅(jiān)實(shí)的科學(xué)基礎(chǔ)，在臨床前階段了解不同療法的潛在重疊毒副作用，從而在臨床試驗(yàn)中及時(shí)評估負(fù)面反應(yīng)和潛在藥物相互作用。在科研人員的不懈努力之下，我們期待早日克服功能性治愈慢性乙肝患者需要面對的挑戰(zhàn)，為世界各地的患者造福。參考資料：
[1] Fanning et al., (2019). Therapeutic strategies for hepatitis B virus infection: towards a cure. Nature Reviews Drug Discovery. https://doi.org/10.1038/s41573-019-0037-0
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[3] RNAi: Pulling Us Toward Finite Therapy. Retrieved August 28, 2019, from http://ir.arrowheadpharma.com/static-files/d6073d43-ba9d-4f8e-b68e-9ba990e59375[4] HBV Treatment Pipeline: Prospects for a CureRetrieved August 28, 2019, from http://media.mycme.com/documents/304/17_peters_final_75913.pdf
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