經好久沒有寫技術性文章了，有點生疏，措辭不太合適的地方，還望各位大佬們多多包涵~
小編最近迷戀上了外泌體的研究，在此分享一下，也希望能讓大家長些知識。
【Endoplasmic Reticulum Stress Promotes Liver Cancer Cells to Release Exosomal miR-23a-3p and Up-regulate PD-L1 Expression in Macrophages
內質網應激促進肝癌細胞釋放外泌體miR-23a-3p并上調巨噬細胞中PD-L1的表達】
孫國平、王華課題組的研究人員在Hepatology雜志發表文章，發現ER應激下的肝癌細胞通過外泌體將特定的miRNA轉移到浸潤巨噬細胞從而影響PD-L1的表達，進而促進肝癌細胞的免疫逃逸。
那么，內質網應激到底是如何影響PD-L1表達呢？
導語
1. 肝細胞癌（HCC）是一種常見的惡性腫瘤，在全世界生存率很低。手術是HCC患者最有效的治療策略，但超過80％的患者在確診時已無法完全通過手術切除。因此，迫切需要對HCC開發更有效的系統治療方式。內質網應激下的肝癌細胞將特定的miRNA通過外泌體轉移到腫瘤微環境中的浸潤巨噬細胞來促進肝癌細胞的免疫逃逸，為肝癌治療提供了新的有效策略。（什么是內質網應激，大家可以看本期第二篇文章）
2. 外泌體被視為特異性分泌的膜泡，參與細胞間通訊。HCC細胞來源的外泌體可轉移miR-23a-3p進而增加PD-L1的表達（miR-23a-PTEN-AKT）。T細胞與Exo-TM（exosomes derived from tunicamycin treated HCC cells）刺激的巨噬細胞共培養降低了CD8+ T細胞比率并減少白細胞介素-2產生，并增加了T細胞凋亡，這些結果表明miRNA是外泌體介導的細胞間通訊的重要分子。
3. 研究結果表明，在腫瘤細胞免疫逃逸過程中， miR-23a-3p通過外泌體（ER應激的HCC細胞）向巨噬細胞的轉移發揮著重要作用，該研究結果為腫瘤細胞如何逃避抗腫瘤免疫提供了新的見解。
研究思路
文章涉及的技術方法
流式細胞術（FCM）
免疫組化（IHC）
免疫熒光（IF）
免疫印跡（WB）
定量聚合酶鏈反應（qPCR）
高通量測序（HTS）
液相色譜-電噴霧電離串聯質譜（LC-ESI-MS / MS）
研究結果
1. 人類HCC中ER應激被激活
免疫組化結果顯示WB、qPCR結果表示，ER應激相關的蛋白（GRP78，PERK，ATF6和IRE1α）在HCC組織中均高表達。（Figure1）
2. ER應激的激活與人HCC的不良生存相關——Kaplan-Meier 曲線表示，過表達GRP78、ATF6、PERK和IRE1α的患者的總體存活率明顯短于低表達水平的患者。（Figure2）
3. ER應激與HCC患者的PD-L1表達有關
表達較高水平的GRP78（GRP78 high）的腫瘤組織在基質中具有大量CD68染色，而在表達低水平GRP78（GRP78 low）的腫瘤組織中CD68 +巨噬細胞浸潤低得多。定量分析顯示GRP78 high腫瘤基質中的CD68 +區域顯著高于GRP78 low基質中的CD68 +區域，有相關報道表示，PD-L1抑制T細胞活化并導致腫瘤免疫逃逸。免疫組織化學分析發現GRP78 high腫瘤中PD -L1分布水平明顯高于GRP78 low腫瘤。此外，qPCR和蛋白質印跡分析顯示，與癌旁組織相比，PD-L1 mRNA和蛋白在腫瘤組織中顯著上調。免疫熒光雙染色，發現GRP78 high HCC腫瘤基質中，PD-L1常與CD68 +巨噬細胞共定位。Kaplan-Meier分析顯示，低表達PD-L1的患者存活時間長于高表達PD-L1的患者。（Figure3）
4. 在體外，ER應激的HCC細胞的外泌體上調巨噬細胞PD-L1的表達
前面結果表明高ER應激狀態與HCC患者巨噬細胞中PD-L1表達上調有關，提示ER應激HCC可能促進巨噬細胞中PD-L1的表達。外泌體是不同細胞類型之間的重要通信者，作者假設ER應激的HCC細胞可以釋放外泌體并隨后上調巨噬細胞PD-L1的表達。在體外，將巨噬細胞分別與HepG2衍生的Exo-con（未處理的HCC細胞外泌體）和Exo-TM（衣霉素處理的HCC細胞外泌體）共孵育，之后做免疫組化、蛋白質印跡和qPCR檢測，結果顯示，Exo-TM增加巨噬細胞中PD-L1的表達。（Figure4）
5. 在體內，Exo-TM上調巨噬細胞中PD-L1的表達
為了確定Exo-TM是否也能增強體內PD-L1的表達。通過小鼠尾靜脈靜脈注射PKH67標記的外泌體，之后對組織進行PD-L1表達水平的檢測（qPCR、免疫組化、蛋白印跡），結果顯示， Exo-TM在體內上調PD-L1的表達。（Figure5）
6. Exo-TM處理巨噬細胞降低了CD8 + T細胞比率并促進T細胞凋亡
有相關報道表明，腫瘤微環境中的巨噬細胞浸潤通過損害CD8 + T細胞的免疫應答來促進腫瘤進展。作者猜想ER應激的HCC細胞是否也是通過損害CD8 + T細胞的免疫應答來促進HCC進展。為了驗證這一假設，作者用流式細胞術檢測Exo-TM處理的巨噬細胞對T細胞的影響。結果顯示，與Exo-con處理的巨噬細胞相比，Exo-TM處理的巨噬細胞顯著降低了CD8 + T細胞比例。此外，使用凋亡檢測試劑盒檢測T細胞凋亡，發現與Exo-TM處理的巨噬細胞孵育后凋亡T細胞的比例顯著高于Exo-con處理的巨噬細胞。（Figure6）
7. ER應激的HCC來源的外泌體含有高水平的miR-23a-3p，通過調節PTEN/AKT通路上調巨噬細胞中PD-L1的表達
為了確定ER應激的肝癌細胞是否通過外泌體向巨噬細胞傳遞特異性miRNA并影響其免疫功能，作者對外泌體進行了高通量測序分析。生物信息學分析結果顯示，miR-29a-3p，miR-23a-3p，miR-486-3p和miR-486-5p被預測通過PTEN-磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）調節PD-L1表達，qPCR分析結果顯示miR-23a-3p在Exo-TM中具有最高的倍數增長。用microRNA數據庫預測發現PTEN是miR-23a-3p的一個假定目標，并通過雙熒光素酶報告基因分析和蛋白質印跡得到證實。有研究報道PTEN可調節PD-L1的表達，用miR-23a-3p mimics處理mTHP-1細胞進行相關指標的檢測。結果顯示， miR-23a-3p上調巨噬細胞中的PD-L1表達。（Figure7）
8. 為了進一步證實miR-23a-3p是否通過激活PTEN / AKT途徑調節PD-L1表達，作者首先將巨噬細胞與Exo-TM或Exo-con共培養，發現與Exo-con相比，Exo- TM顯著下調PTEN并上調p-AKT。此外，qPCR分析證明，與Exo-con相比，Exo-TM顯著增加了共孵育的巨噬細胞中miR-23a-3p的表達。用miR-23a-3p inhibitor轉染巨噬細胞消除了Exo-TM介導的PTEN下調和p-AKT上調。之后，作者對PTEN進行敲低，發現PTEN的敲低顯著上調巨噬細胞中PD-L1蛋白表達。以上結果表明，Exo-TM通過抑制PTEN和隨后的AKT途徑激活上調巨噬細胞中PD-L1的表達。（Figure8）
結論：結果表明，HCC細胞可以通過外泌體向浸潤的巨噬細胞傳遞ER應激信號miR-23a-3p分子（miR-23a-PTEN-AKT途徑），進而促進腫瘤的發生。
