摘要
基于乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染的免疫病理機制，可以采用多種創新策略來增強患者的HBV特異性免疫反應。多種模式識別受體（PRR），如Toll樣受體（TLR）、維甲酸誘導基因蛋白I（RIG-I）和干擾素基因刺激蛋白（STING），能夠參與HBV的免疫識別。口服、鼻腔或皮下使用PRR激動劑可激活宿主免疫細胞和肝實質細胞及非實質細胞（NPCs），促進IFN和促炎細胞因子的產生，以及干擾素刺激基因（ISGs）的表達。
治療性疫苗和檢查點阻斷劑可以誘導和增強HBV特異性細胞毒性T淋巴細胞（CTLs）。過繼轉移體外活化的T/NKT細胞或基因編輯的HBV特異性T細胞能夠更新替代體內耗竭或低能的T細胞，其中最具有代表性的是嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）和T細胞受體T細胞（TCR-T）。盡管部分作用已經得到了驗證，但臨床使用之路仍然橫亙著重重阻礙。
慢性乙型肝炎（CHB）抗病毒治療的最終目標是追求以HBsAg丟失為主要特征的“功能性治愈”。但目前可用的治療策略只能在不到10％的CHB患者中實現“功能性治愈”。臨床使用的口服核苷（酸）類似物（NUCs）可抑制HBV復制，安全性高，但很少發生HBsAg清除及血清學轉換，停藥無期；聚乙二醇干擾素α（PEG-IFN-α）可使10％~30％的患者清除HBeAg，并發生HBsAg血清學轉換，兼具免疫調節特性；但耐受性差，存在不良反應，以及需要皮下給藥。
HBV特異性免疫應答功能障礙被認為是持續感染的主要原因。恢復或增強固有免疫，并誘導HBV特異性適應性免疫應答可能有助于清除HBV。與急性乙型肝炎相比，慢性乙型肝炎（CHB）的免疫應答具有以下特點：HBV特異性CD4?/CD8? T細胞、DCs和NKs/NKTs功能障礙或數量減少；免疫檢查點蛋白程序性死亡受體1（PD-1，CD279）、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（CTLA-4，CD152）、T細胞免疫球蛋白黏液素3（Tim-3，CD366）等負性調節因子表達上調；固有免疫應答受損，TLR下調和失活。
在HBV感染過程中，肝免疫系統首先對門靜脈的抗原產生耐受。受損的肝細胞釋放精氨酸酶和吲哚胺-2,3-雙加氧酶（IDO）等，消耗維持T細胞功能所需的氨基酸，從而抑制T細胞功能。肝內炎癥募集調節性T細胞（Treg）、B細胞和骨髓來源的抑制性細胞（MDSCs），并激活星狀細胞，產生IL-10和TGF-β。肝臟的免疫抑制可避免炎癥引發的嚴重損傷，但也損害了HBV特異性T細胞的功能。高水平的HBV DNA、HBsAg和HBeAg有助于維持CHB患者的HBV特異性免疫耐受。目前已經證明，從抗-HBs陽性供體中過繼轉移骨髓可在受體中實現HBV清除；肝移植可將免疫細胞從接種疫苗的供體轉移到受體，并部分控制肝臟的再感染。這些發現提示，免疫調節具有治療HBV感染的潛力，越來越多的研究開始探究小分子等免疫治療策略。
01
增強固有免疫以建立抗病毒狀態：臨床前研究
模式識別受體激動劑：
TLR配體：TLRs廣泛表達于免疫細胞和肝實質/非實質細胞，可識別病毒和細菌的病原體相關模式分子（PAMPs），在固有免疫中發揮重要作用，并銜接適應性免疫。Isogawa等首先證明，對HBV轉基因小鼠模型單獨使用TLRs-3、4、5、7和9的特異性配體，可在24小時內以非細胞毒性的、IFN依賴性的方式抑制肝內HBV復制。TLR配體可通過IFN依賴性和非依賴性途徑有效抑制原代肝細胞和肝癌細胞中的HBV復制。TLR-2和4的激動劑在肝癌細胞和土撥鼠肝細胞中能夠抑制土撥鼠肝炎病毒（WHV）復制。用TLR配體刺激NPCs（KCs和LSECs）和DCs可誘導一系列抗病毒因子（如I型IFN）的合成，在體外抑制HBV復制。TLR激動劑不僅可以激活肝臟中的實質細胞、NPCs和浸潤的免疫細胞，還可以募集循環中的免疫細胞以建立抗病毒狀態。TLR激動劑主要誘導炎性細胞因子和趨化因子應答。最近有研究發現，TLR激動劑可通過代謝調節直接促進T細胞功能。但需要考慮TLR激動劑帶來的全身炎癥反應。
TLR-9 的天然配體是病毒和細菌基因組中的非甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤二核苷酸序列 (CpG)。連續16周，每周向慢性感染WHV的土撥鼠皮下注射CpG寡脫氧核苷酸（CpG ODN）可誘導IFN的合成，出現較弱的短暫病毒抑制作用。有研究表明，CpG ODN可以增強抗病毒治療的效果。
GS-9620是TLR-7的一種配體，已在土撥鼠和黑猩猩模型中展現出了治療潛力；GS-9620可在人PBMCs中誘導多種HBV抑制因子，延長PHH和HepaRG細胞中I型IFN相關的HBV抑制作用，增強免疫蛋白酶體亞基的合成，并可能暴露感染HBV的PHH中的一種免疫優勢病毒多肽，促進宿主的T細胞識別和激活并控制病毒。
圖1. GS-9620作用機制
【Niu C, Li L, Daffis S, et al. Toll-like receptor 7 agonist GS-9620 induces prolonged inhibition of HBV via a type I interferon-dependent mechanism. J Hepatol. 2018;68(5):922‐931. doi:10.1016/j.jhep.2017.12.007】
RIG-I激動劑：SB9200是RIG-I和核苷酸結合寡聚化結構域蛋白2（NOD2）的激動劑。WHV感染的土撥鼠口服該激動劑12周后可延長血液/肝中IFN-α/β和ISG的活化，降低血清WHV DNA和WHsAg；在使用恩替卡韋（ETV）后序貫使用SB9200可以更顯著地抑制WHV，延遲病毒復制的反彈。因此，SB9200誘導的宿主應答增強了NUCs的抗病毒效應。
STING激動劑：宿主的環狀GMP-AMP合成酶（cGAS）可以識別HBV DNA并激活其接頭蛋白STING，促進ISG56表達并抑制病毒組裝。雙鏈DNA（dsDNA）或環鳥苷酸-腺苷酸（cyclin GMP-AMP， cGAMP）激活cGAS-STING通路，可顯著抑制細胞和小鼠模型中HBV的復制。小鼠STING的激動劑5,6-二甲基黃嘌呤酮-4-乙酸（DMXAA）在水壓動力構建的HBV小鼠模型中顯著誘導ISG的表達并減少肝臟HBV DNA的產生。DMXAA主要誘導I型IFN主導的細胞因子反應。人肝細胞中STING的表達尚存爭議。用cGAMP或DMXAA處理感染HBV的肝癌細胞可顯著抑制HBV復制，胞內HBV mRNA、核心相關DNA和分泌的HBsAg降低，但cccDNA數量無明顯改變。
MITA（Mediator of IRF3 activation）相關蛋白（MRP）是MITA/STING的剪接異構體，可特異性阻斷MITA相關的IFN激活，同時仍誘導NF-κB通路。MRP過表達小鼠的HBV復制受到抑制；反之，MITA/STING缺陷增強了小鼠的HBV復制。MITA/STING缺陷動物的HBV特異性體液免疫應答和CD8? T細胞應答減少，表明MITA/STING在抗HBV免疫的固有和適應性應答中發揮重要作用。總而言之，STING有望成為CHB免疫治療的靶點。
圖2. 增強固有免疫并建立抗病毒狀態的方法。激活固有免疫可誘導抗病毒和炎性介質的產生，并在不同程度上抑制病毒；適應性免疫也不可或缺。目前只有TLR7配體GS-9620已在臨床試驗中進行了測試。
APOBEC調節的脫氨：載脂蛋白B mRNA編輯催化多肽 (APOBEC) 家族是一類高效的胞苷脫氨酶。其中，APOBEC-3參與宿主對HBV的固有免疫，最早在2005年報道人APOBEC-3能夠通過胞苷脫氨作用編輯HBV DNA。在感染HBV的HepAD38和HepG2.2.15細胞中，內源性胞苷脫氨酶可以編輯病毒衣殼內10–25％的HBV rcDNA基因組。熱休克蛋白90（Hsp90）可增強APOBEC-3介導的HBV DNA脫氨活性。APOBEC-3酶可能通過胞苷脫氨作用介導I型IFN和淋巴毒素的抗病毒活性，從而導致cccDNA降解。
圖3. 高劑量IFN-α處理或LTβR激活分別上調A3A和A3B的表達，隨后它們在感染的肝細胞中與HBV核心蛋白共定位或直接相互作用，移位到細胞核，在HBV核心蛋白的作用下與cccDNA緊密接觸。APOBEC可以使在轉錄過程中瞬時變成單鏈的cccDNA脫氨基。HBV cccDNA中的尿嘧啶被細胞DNA糖基化酶識別并切除，導致脫嘌呤嘧啶（Apurinic/Apyrimidinic，AP）位點的形成；AP 位點被細胞AP核酸內切酶識別，cccDNA因此被降解。
【Lucifora J, Xia Y, Reisinger F, et al. Specific and nonhepatotoxic degradation of nuclear hepatitis B virus cccDNA. Science. 2014;343(6176):1221‐1228. doi:10.1126/science.1243462】
02
誘導HBV特異性免疫應答
（1）蛋白質/多肽疫苗：
HBsAg/preS疫苗：常規HBsAg疫苗在動物模型或CHB患者中治療效果不理想，這歸因于HBsAg特異性免疫耐受。而使用IL-12作為佐劑時，HBsAg免疫接種可有效逆轉HBV感染小鼠對HBV蛋白的系統性耐受，HBV特異性CD8?/CD4? T細胞應答增強，CD4? Foxp3? Treg細胞減少。大多數接種基于IL-12的疫苗的動物血清HBsAg轉陰，肝細胞中HBcAg低于檢測下限。preS1多肽也可以增強HBV感染小鼠的免疫應答。序貫使用preS1和HBsAg疫苗，抗preS1抗體可以清除HBV病毒顆粒，甚至引起HBsAg/HBsAb血清學轉換。
HBcAg疫苗：在HBV復制得到控制的CHB病例中，HBcAg特異性CTLs水平顯著升高，因此基于HBcAg的疫苗有望用于治療CHB。含有HBcAg aa18–27和Th表位的疫苗在CHB患者中激發了低水平的CTL活性，但未能清除HBV。
HBsAg/HBcAg復合疫苗：在野生型C57BL/6小鼠和HBV轉基因動物中，包含HBsAg、HBcAg和CpG佐劑的治療性疫苗可引起強烈的HBsAg/HBcAg特異性體液免疫應答，對HBsAg的Th1/Th2應答以及對HBcAg的Th1型應答保持平衡。HBsAg/HBcAg特異性細胞免疫應答增強，可顯著降低HBV轉基因小鼠的血清HBsAg水平，且不導致肝損傷。HBsAg、HBcAg和佐劑ISCOMATRIXTM組成的疫苗可以在HBV轉基因（HBV-Tg）小鼠中誘導多特異性和多功能T細胞，特別是HBc特異性CD8? T細胞，使IFN-γ、TNF-α和IL-2產量增加。4次接種后，8只動物中有7只抗-HBs滴度超過10000 IU/L；在2次和4次接種后，HBV-Tg小鼠外周血HBV DNA減少，但沒有統計學意義。HBcAg陽性肝細胞也顯著減少，無明顯肝損傷。
抗HBsAg抗體：抗體介導的免疫療法已在多項臨床前及臨床研究中被評估，未展現出長效的HBV抑制作用。針對HBsAg的單克隆抗體（mAb E6F6）可在多種小鼠模型中有效抑制持續性HBV復制，在HBV轉基因動物中顯著減少HBsAg和HBV DNA，效果長達數周。在人肝嵌合小鼠模型中，E6F6不僅可以有效預防原發性HBV感染，而且可以減少被感染肝細胞的繼發性HBV傳播。水壓動力注射建立的HBV持續復制的小鼠經過基于E6F6的免疫治療后，抗HBV T細胞應答得以恢復。依賴Fcγ受體的吞噬作用被認為在E6F6相關的病毒免疫清除中發揮最關鍵的作用。
DNA疫苗：編碼HBsAg和HBcAg的DNA疫苗可誘導針對這兩種HBV抗原的體液免疫和細胞免疫應答。在肌肉和皮下注射疫苗后，肌細胞和抗原提呈細胞原位表達的HBsAg和HBcAg被處理并呈遞給宿主免疫細胞，激活特異性B和T細胞。動物實驗表明，多種方法可以提高DNA疫苗的效力，如整合免疫刺激性細胞因子、與NUCs聯用、初免-加強免疫方案、電穿孔遞送、檢查點阻斷等。
基于病毒載體的疫苗：多項研究表明，基于病毒載體（如水泡性口炎病毒，VSV）的疫苗在誘導T細胞方面優于其他類型的疫苗。
總而言之，目前可用的疫苗在臨床前或臨床研究中收效甚微。如何將活化的免疫細胞募集到肝臟中，并在肝臟中維持和增強HBV特異性免疫，仍是需要克服的難題。
（2）HBV特異性T細胞療法：
DC疫苗：DC細胞是最強大的抗原提呈細胞，在固有免疫與適應性免疫之間發揮重要作用。在免疫移植實驗中，髓樣DCs（mDCs）能夠調節HBV特異性CD8? T細胞的功能分化。CD40刺激mDCs可恢復T細胞功能。在HBV轉基因小鼠模型中，HBsAg激發的DCs可以誘導HBsAg特異性免疫應答；HBcAg激發的DCs誘導HBsAg和HBcAg特異性T細胞應答，從而導致HBsAg丟失與抗-HBs血清學轉換。
CIK/DC-CIK：細胞因子誘導的殺傷（CIK）細胞是通過用IFN-γ、抗CD3抗體、IL-1和IL-2離體處理PBMC或臍帶血單核細胞產生的，兼具T和NK細胞樣表型（CD3? CD56?）。CIK細胞以MHC限制性和非限制性方式靶向被感染細胞和癌細胞，誘導快速和普遍的免疫反應。DC-CIK指CIK細胞與DC細胞共培養，或自體DCs和CIKs的序貫過繼轉移。DCs（尤其是抗原激發的DCs）可以刺激NK細胞并啟動抗原特異性T和B細胞應答。越來越多的證據表明，DCs的加入可以減少CIK細胞培養中的調節性T細胞的數量，并增加CD3? CD56?細胞比例。
免疫檢查點抑制劑：免疫檢查點（如PD-1/PD-L1信號通路）的阻斷劑可以減輕特異性T細胞的負性調節作用，或者復蘇耗竭的T細胞。近期的一項離體研究表明，使用OX40刺激聯合PD-1通路阻斷劑可增強HBV特異性CD4? T細胞的功能。在HBV攜帶者中，PD-1阻斷劑可恢復病毒特異性的CD8? T細胞；其他檢查點分子（如Tim-3和CTLA-4）的阻斷劑也可恢復CHB患者病毒特異性CD8? T細胞應答。
基因編輯的T細胞（CAR/TCR-T）：CHB患者因為不同的免疫耐受機制，缺乏有效的T細胞應答以清除病毒。目前基于T細胞的療法使用功能良好的T細胞庫取代或增強宿主體內低能或耗竭的T細胞庫，并靶向病毒特異性免疫優勢表位，有望長效控制HBV感染。但這種療法也存在著一些問題，如T細胞介導的強大殺傷作用可能導致嚴重的肝損傷和急性肝衰竭；以及需要證明工程化的T細胞功能得到改善，且在肝臟的免疫耐受條件下仍可保持功能。
改造的CAR-T細胞可以非MHC依賴的方式識別抗原，與天然T細胞相比有著更為廣闊的靶點。Bohne等研發出靶向HBsAg的CAR-T細胞，針對HBsAg的“a”決定簇和preS1蛋白的aa37-43，識別HBsAg陽性的人原代肝細胞和HepG2.2.15細胞，并特異性清除被HBV感染的靶細胞。HBV-TCR-T細胞、HBsAg-CAR-T細胞等正處于細胞/動物實驗中。
圖4. 誘導HBV特異性免疫應答和重新控制HBV感染的策略。
03
當前基于免疫療法的臨床試驗
已有多種免疫療法投入動物實驗，但只有部分進入了臨床試驗階段。一些療法在土撥鼠模型中發揮了作用，但在慢乙肝患者身上卻未能奏效。
表1. 基于免疫療法的現有臨床研究。
GS-4774是基于酵母菌的重組疫苗，包含HBV特異性抗原（如HBx蛋白和HBsAg大蛋白）。GS-4774的安全性、耐受性和免疫原性已在健康受試者中得到驗證，但在Ⅱ期臨床試驗中，GS-4774未能抑制CHB患者體內的病毒，HBsAg未顯著減少。總之，盡管GS-4774能夠刺激宿主CD8? T細胞，但不足以控制HBV。
鼻疫苗候選藥（NASVAC）由HBsAg和HBcAg組成，目前已進入III期臨床隨機對照試驗，療效略優于Peg-IFN，還需要進一步驗證。
HBsAg-乙型肝炎免疫球蛋白（HBIG）復合物（YIC）已通過II期臨床試驗。在HBeAg陽性的CHB患者中，YIC接種組與對照組相比，HBeAg血清學轉換率升高，病毒載量降低。但是，III期臨床試驗沒有呈現出令人滿意的結果。
HepTcell是包含HBV特異性T細胞表位的九種合成肽的混合物。在英國和韓國進行的I期臨床試驗中，向接受ETV或TDF治療的HBeAg陰性CHB患者注射HepTcell三周，耐受良好，并能誘導針對患者體內HBV抗原的細胞免疫應答。
DNA疫苗的安全性已在I/II期臨床試驗中得到驗證，但與NUCs聯用收效甚微。在接受拉米夫定治療的HBV攜帶者中，含有大部分HBV基因組和IL-12 DNA的DNA疫苗能夠產生病毒學應答。攜帶HBsAg、HBcAg和聚合酶（TG1050）的非復制型腺病毒載體在小鼠模型中展現出強烈的HBV多特異性和T細胞應答延長的特點。一項Ib期研究證明了TG1050的安全性和免疫原性，有望在將來與抗病毒藥物聯用。
抗PD-1抗體Nivolumab單抗已進入Ib期研究，單獨給予Nivolumab單抗或與GS-4774聯用均可以在12周降低HBsAg水平。
目前有多種口服TLR-7/8激動劑正在進行臨床試驗，包括GS-9620、RO7020531、RG7795（ANA773）、RG7854、JNJ-4964（AL-034/TQ-A3334）和GS-9688。GS-9620的安全性已經得到了驗證，但GS-9620并不能顯著降低HBsAg水平，其療效還有待進一步評估。TLR-7激動劑RO7020531正處于I期臨床試驗之中。
AIC649是已獲得專利的滅活副痘病毒（iPPVO），可以誘導對非相關病原體的、自然自限的免疫反應。使用AIC649后，即便停藥，土撥鼠模型體內的WHsAg也顯著減少。
此外，DC/DC-CIK也已經投入了臨床研究，但還需要更多的隨機對照研究來驗證其療效。
總之，基于免疫療法的臨床試驗尚未取得令人滿意的結果，免疫療法不僅需要誘導適應性免疫，還需要克服病毒慢性感染過程中的負性免疫調節。
04
基于IFN-α的免疫療法
PEG-IFN-α具有抗病毒和免疫調節作用，仍然是治療CHB患者最有效的藥物。PEG-IFN-α會促進HBsAg的丟失，尤其是在給予NUCs且HBsAg滴度小于1000 IU/mL的患者中。若將Peg-IFN-α多樣化地整合到多種藥物方案中，例如降低劑量或間歇使用以避免嚴重的不良反應，則可能對HBV感染的治療作出重要貢獻。
Peg-IFN-λ是一種III型IFN，被認為對CHB的固有免疫和適應性免疫具有雙重的免疫調節作用。IFN-λ與IFN-α具有相似的ISG誘導途徑，抗病毒作用相似。因為IFN-λ結合的干擾素受體被限制在上皮來源的細胞（如肝細胞），預期PEG-IFN-λ的耐受性可能會優于PEG-IFN-α。
圖5. HBV生命周期及抗HBV相關ISGs的作用階段。
【引自楊舒雅,向寬輝.乙型肝炎病毒感染與干擾素介導的固有免疫應答的研究進展[J].中國病毒病雜志,2019,9(04):303-310.】
總結
慢性HBV感染被認為是HBV特異性免疫耐受的結果。因此打破免疫耐受并恢復HBV特異性免疫反應有助于患者控制和清除HBV。但到目前為止，基于該策略的嘗試效果并不理想，還存在肝損傷的風險。因此，未來需要將有效的抗病毒治療和精心設計的免疫調節相結合。
近幾年對HBV特異性T細胞介導的抗病毒作用研究較多，B細胞和NK細胞也還需要更多的關注。多種宿主基因決定因素有助于抑制HBV，如UBE2L3基因可通過控制cccDNA穩定性和未知過程調節HBV復制。
cccDNA和/或整合的HBV DNA在肝細胞中對于HBV慢性感染的“功能性治愈”具有重要影響。免疫療法有可能清除大部分具有cccDNA和/或整合HBV DNA的感染肝細胞，從而降低肝癌發生發的風險。
Seminar: “Immunobiology of Chronic Hepatitis B” Mala Maini PhD FRCP FMedSci
文獻來源：
Meng Z, Chen Y, Lu M. Advances in Targeting the Innate and Adaptive Immune Systems to Cure Chronic Hepatitis B Virus Infection. Front Immunol. 2020;10:3127. Published 2020 Feb 7. doi:10.3389/fimmu.2019.03127
（來源：片警實驗室）
