作者：堯小飛
審稿：童蒙
編輯：angelica
引言
這幾年單細胞實驗和分析技術如雨后春筍般涌現，相關文章也層出不窮，各種軟文也是鋪天蓋地。作者嘔心瀝血整理了一篇關于單細胞的長文，詳細介紹單細胞轉錄組分析的整體分析。本文是第一篇，我們一起來看看單細胞轉錄組的基本知識。
01 什么是單細胞轉錄組？
單細胞轉錄組就是某一時刻單個細胞內所有mRNA總表達量，其表達量反映該細胞的總體特征。隨著2009年湯富酬老師首先開發單細胞轉錄組技術后，單細胞轉錄組技術如雨后春筍般涌現出來，比如Smart-seq、CEL-Seq、Quartz-Seq、Drop-seq、InDrop-seq、Smart-seq2等等。單細胞轉錄組技術的出現使得我們可以把研究的精度從組織多細胞層面精確到單個細胞領域，可以單獨研究某個細胞或者某群細胞具體的特征，特別是對于細胞發育、腫瘤微環境、單細胞圖譜繪制方面發揮了關鍵作用。
單細胞轉錄組的平臺有很多，常用的有10xGenomics、BD Rhapsody、Fluidigm C1、Bio-Rad等平臺，其中10xGenomics單細胞轉錄平臺由于其成本優勢和通量優勢，是最常見的一種單細胞解決方案提供商，其在市場上處于絕對優勢。10xGenomics單細胞轉錄組平臺能夠一次高效地捕獲100-80,000細胞（一個芯片），1000個細胞的雙細胞率僅為0.9%，是目前最為常用的單細胞捕獲平臺。
在這里主要也是介紹基于10xGenomics單細胞轉錄組平臺數據進行的后續生信分析以及注意事項。
02 為什么要進行單細胞轉錄組研究？
普通轉錄組（Bulk RNA）是生物組織樣品中在某個時間對應的所有mRNA轉錄情況，通常作為組織或者樣品某個時刻狀態的重要指標，不同的樣品、不同組織、不同物種、不同的處理都會造成mRNA表達情況的改變，從而調控機體的生命狀態或者執行某些細胞功能，相對于蛋白而言，mRNA的穩定性和檢測的便利性，大大促進了轉錄組技術的發展和應用。
Bulk RNA表達水平是反映樣品的平均表達量水平
“Every cell is unique—it occupies an exclusive position in space, carries distinct errors in its copied genome and is subject to programmed and induced changes in gene expression. Yet most DNA and RNA sequencing is performed on tissue samples or cell populations, in which biological differences between cells can be obscured by averaging or mistaken for technical noise.” ----Method of the Year 2013(Nature Methods )
但是樣品或者組織的轉錄組是所有細胞的一個轉錄組表達量的平均值，不能反映樣品中所有細胞或者某群細胞的狀態，因此需要對單個細胞的或者某群細胞的轉錄狀態進行深入的研究，這樣將更精細、更準確反映組織的狀態。 如果在進行免疫或者藥物反應研究的時候，可以更精準地針對細胞或者細胞亞群進行免疫治療或者靶向治療，這是精準醫療必要條件。
03 怎樣進行單細胞轉錄組研究？
在思考這個問題之前，我們首先需要考慮的是什么是單細胞轉錄組？只有了解單細胞轉錄組本質以后，才能更好了解如何去研究？
10xGenomics單細胞轉錄組基本流程如下圖所示，我們最終得到的是一個表達矩陣，此矩陣一般每行為基因，每列為細胞。其實這個矩陣就是每個細胞所有的基因表達情況。
后續10xGenomics單細胞轉錄組的分析幾乎都是基于上述方式得到的表達矩陣進行分析的，不管是聚類還是發育軌跡構建，其實單細胞轉錄組研究的本質就是研究我們捕獲細胞的的異質性，也就是研究細胞與細胞具體有什么差異，研究樣品中有什么類型的細胞，這些細胞有什么差異。
異質性具體如何研究？雖然現在單細胞轉錄組分析的工具和方案有幾百種，就本質來說，只有兩種研究方法：一種是細胞類型的差異；另外一種是發育軌跡的構建?，F在所有的工具都可以歸類到此兩類。
單細胞轉錄組表達矩陣的獲取
10xGenomics單細胞轉錄組表達矩陣一般是通過cellranger軟件獲取，cellranger為10xGenomics官方分析軟件，一般后續高級分析或者重新分析都是基于此矩陣。
具體cellranger使用方法如下圖所示：
一般cellranger資源消耗如下圖所示：
這一篇我們對基本知識進行了介紹，同時講解了如何獲得表達量矩陣。下一篇我們會介紹詳細的單細胞轉錄組亞群分析過程和原理，請大家繼續關注。
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