細胞外囊泡(EV)介導體內細胞間生物分子交換，使其成為治療性貨物的有前途的運載工具。CRISPR系統的基因工程是治療杜氏肌營養不良癥(DMD)等遺傳疾病的有趣途徑。近日，Molecular Therapy雜志上的一篇文章報道發現利用血清的細胞外囊泡遞送CRISPR-Cas9核糖核蛋白，修改抗肌萎縮蛋白（dystrophin）基因，允許dystrophin在肌纖維中表達。這種方法為快速、安全地遞送CRISPR成分來治療DMD開辟了新的機會。
杜氏肌營養不良(DMD)是一種遺傳性疾病，由DMD基因的各種突變引起，這些突變會損害抗肌萎縮蛋白（dystrophin）的表達。大約70%的患者有一個或多個外顯子缺失導致移碼突變。其他30%有無義點突變。目前正在研究針對這種疾病的各種治療方法。
目前只有外顯子跳躍被批準商業化。該技術使用針對剪接受體或剪接供體位點的反義寡核苷酸(ASO)從最終mRNA中去除患者缺失之前或之后的外顯子。這種治療可以恢復抗肌萎縮蛋白的表達，但不一定能恢復其全部活性。事實上，肌營養不良蛋白的中心部分由24個血影蛋白樣重復(SLR)組成，其起點和終點與外顯子跨度不匹配。因此，取決于被刪除的外顯子，SLR結構或多或少是正常的，這可能導致嚴重貝克爾患者的表型。
正在研究的另一種方法是使用編碼微肌營養不良蛋白的AAV。經過多年的研究，已經產生了各種微肌營養不良蛋白基因，并在小鼠和狗身上顯示出令人鼓舞的結果。然而，一名年輕的DMD患者在使用微量肌營養不良蛋白治療的臨床試驗期間意外死亡，導致該臨床試驗的暫停。
通過CRISPR-Cas9技術進行基因編輯已顯示出糾正或繞過DMD突變的有希望的結果：DMD小鼠脛骨前肌(TA)肌肉中的抗肌萎縮蛋白表達已通過在DMD基因中單次切割CRISPR-Cas9以觸發外顯子跳躍而得到拯救，并通過雙切割刪除突變并創建雜合外顯子。使用CRISPR堿基編輯在DMD基因中進行核苷酸替換也成功地恢復了DMD模型中的肌營養不良蛋白表達。大多數體內CRISPR編輯的遞送方法都涉及AAV。然而，在臨床試驗期間，AAV已被證明會引起許多不利影響，例如對人類的肝毒性、神經和血液學影響。此外，先前暴露于天然存在的AAV的現有抗體以及這種治療的高昂成本，可能阻礙了患者接受基于AAV的治療。
最近，已開發出基于細胞外囊泡(EV)的系統以在體內遞送CRISPR-Cas9。EV由所有類型的細胞產生，可以跨越生物屏障并避開單核吞噬系統，這些特性使它們成為有前途的藥物輸送載體。CRISPR核糖核蛋白復合物(RNP)在轉染轉基因Cas9基因后成功包裝在源自HEK293T的EV中，該基因與對EV貨物具有高親和力的蛋白質結構域融合。使用超聲處理將RNP體外包裝到已經純化的HEK293T衍生EV中也很成功。使用EV傳遞CRISPR系統的活性劑的一大優勢是它們允許傳遞Cas9蛋白而不是Cas9基因，這避免了其持續表達，從而降低了免疫反應和脫靶突變的產生。然而，癌細胞衍生的EV的使用引發了人類治療的安全問題，因為它們攜帶可能與RNP共同遞送的潛在致癌物質。
該研究證明，可以使用從血清中純化的EV來傳遞SpCas9蛋白和2個gRNAs來刪除有問題的外顯子，而不是使用AAV或HEK293T衍生的EV。血清EV已顯示出再生治療的巨大潛力，特別是在營養不良小鼠中恢復膜完整性和肌肉功能。與其他方法相比，血清EV為CRISPR遞送提供了一個安全且具有成本效益的高效平臺。
該研究開發了一種簡單的方法，用EV裝載由SpCas9蛋白和引導RNA(gRNA)組成的CRISPR核糖核蛋白(RNP)。首先使用超濾和尺寸排阻色譜法從人或小鼠血清中純化EV。使用蛋白質轉染劑將RNPs加載到血清EVs中，研究發現EVs在體外是RNPs的良好載體，并恢復了tdTomato熒光蛋白在Ai9小鼠肌肉纖維中的表達。攜帶靶向DMD基因內含子22和24的RNP的EV被注射到在外顯子23中具有無義突變的mdx小鼠的肌肉中。從處理過的mdx小鼠中提取的多達19%的cDNA具有預期的外顯子23和24缺失，允許肌營養不良蛋白在肌纖維中表達。這種方法為快速、安全地遞送CRISPR成分來治療DMD開辟了新的機會。
參考文獻：
Majeau N, Fortin-Archambault A, Gérard C, Rousseau J, Yamégo P, Tremblay JP. SERUM EXTRACELLULAR VESICLES FOR DELIVERY OF CRISPR-CAS9 RIBONUCLEOPROTEINS TO MODIFY THE DYSTROPHIN GENE. Mol Ther. 2022 May 25:S1525-0016(22)00321-5. doi: 10.1016/j.ymthe.2022.05.023. PMID: 35619556.
