本次主要介紹一下DNA的甲基化和羥甲基化的高通量測序。DNA的甲基化是在DNA的序列不變的條件下，在其中某些堿基上加上甲基的這樣一個過程。
DNA甲基化的結果，一般是使甲基化位點的下游的基因表達量變少。
這個（甲基化）分析方法當中的核心化學反應，是用亞硫酸氫鹽來處理DNA。DNA當中，沒有甲基化或羥甲基化的C堿基，就會被轉化成U堿基。我們來看這個轉化的過程，在弱酸性條件下，亞硫酸氫根會結合到沒有甲基化的C堿基的6位。而甲基化了的C堿基不會和亞硫酸氫根發生這個反應的。
然后，用堿來處理。結合了亞硫酸氫根的非甲基化的C，就被脫氨基，并且脫亞硫酸根。然后，就被轉化成U堿基。
那么，甲基化或者羥甲基化的C堿基，因為之前沒有和亞硫酸氫根起反應，所以現在用堿來處理，它也不會發生脫氨基反應。所以，它還保持了是“C”。用亞硫酸氫鹽來處理DNA，可以讓99%左右的非甲基化的C堿基變成U。也就是說這種方法的的轉化效率非常高，轉化效率達到了99%。
它的優點，就可以讓我們接下來通過高通量測序的方法，可以精確地看到單個堿基的甲基化的水平。經過亞硫酸氫鹽轉化過的DNA，再經過PCR，PCR新合成出來的鏈，U堿基的位置，就會被替換成了“T”。那么在接下來的測序過程中，測到的也是T堿基。而甲基化的C，因為沒有被亞硫酸氫鹽所轉化，所以，在接下來的測序過程中，被測到的，還是“C”堿基。這樣，通過測序，看一個位置是“C”，還是“T”。如果它保持是“C”，就說明這個位置是被甲基化、或者羥甲基化了。如果測到的是“T”，就說明這個位置是沒有被甲基化、或者羥甲基化。
甲基化的建庫過程。
第一種，用Illumina公司的Truseq DNA建庫方法，來做甲基化測序。
因為Illumina Truseq DNA建庫試劑盒當中，它所提供的接頭，那么這個接頭上的C堿基都是已經經過甲基化修飾了。所以，用這些接頭做出來的文庫，在用亞硫酸氫鹽做轉化的過程當中，它的（接頭上的）C還是保持是C ，不會被轉成U。帶了這些接頭的文庫分子，就可以和測序芯片上的草皮DNA發生互補雜交。并且進一步發生橋式PCR反應。生成測序用的DNA的簇（Cluster）。但是，這個方法有一個缺點，就是在用亞硫酸氫鹽處理DNA文庫的時侯，90%以上的DNA鏈會斷掉。這樣，已經建好的文庫，其中90%分子會被破壞掉。也就是說文庫的豐富度就會損失90%以上。那么，相應的它有它的好處，它的好處就是，在這個建庫過程當中用的PCR循環數較少。所以它PCR擴增效率不同，所引起的文庫不均一程度也就較低。也就是我們通常所說的PCR bias較少。
第二種建庫方法。為了解決文庫豐富度受到損失的這個問題，EpiCentre公司開發了EpiGnome方法，方法的操作過程如圖。
第1步，亞硫酸氫鹽先處理DNA，把未甲基化的C都轉變成U。
第2步，把帶標簽1的隨機引物加入，進行第一次的復制。得到第1條的復制鏈。
第3步，是消化掉過量的引物。
第4步，是加入帶末端終止堿基、并帶標簽2的隨機引物。這個引物的作用是讓第1復制鏈延伸，并且加上標簽2。
第5步是加入建庫的PCR引物，進行PCR。通過PCR，把Index序列和成簇引物序列加入到鏈的兩側。得到真正的文庫。
這個方法的優點是，把亞硫酸氫鹽處理的過程，放在了建庫之前。這樣建成的庫的豐富程度會比較高。但是這個方法也有缺點，缺點就是要做較多的PCR循環，那么有了比較多的PCR循環之后，PCR產物的擴增均一性是不太好的。也就是說PCR bias會比較大。
上述兩種方法，各有優缺點。
在Illumina的HiSeq 2000或者2500平臺上進行測序，如果文庫是堿基平衡的文庫，也就是說，每個特環當中，A/C/G/T四種堿基的比例，各占25%左右的話，測序儀對堿基的判讀會比較好。但是如果缺少了一種或者幾種堿基，測序儀對堿基的判讀就會出問題。測序得到的數據質量就會下降。并且效的數據產量也會降低。因為甲基化文庫中經過亞硫酸氫鹽處理，絕大多數的C都變成了T。所以，這個文庫中是嚴重地缺少C堿基的，也就是四種堿基的比例是嚴重不平衡的。這樣在用HiSeq 2000或2500測序儀來測甲基化文庫的過程當中，文庫測序得到的數據質理就較差。并且經過PF過濾得到的有效的數據產量也會較低。
為了彌補甲基化文庫的堿基不平衡性，一般情況下，在上機過程當中，是摻入大比例的基因組文庫，或者PhiX文庫，來補充比較多的C堿基，一般會摻30%的PhiX文庫、或者基因組文庫。
在摻入30%的PhiX文庫的條件下，一條HiSeq 2000 V3 PE100的Lane，大概可以得到20G 左右的甲基化文庫數據。也就是說，在HiSeq 2000或者2500平臺上，甲基化文庫的測序數據產量，一直都不是很高。質量也比較低。
接下來，我們說一下區分“羥”甲基化和甲基化的測序方法。
在用單純的亞硫酸氫鹽法來測的過程當中，甲基化和差甲化的C堿基都不能被轉化成U堿基，所以單純的亞硫酸氫鹽法是無法區分甲基化或羥甲基化的C堿基的。
為了區分甲基化和羥甲基化，科學家想出了兩種辦法。
第一種辦法，是通過高釕酸鉀（KRuO4）來氧化羥甲基化的C。羥甲基化的C可以被轉化成甲酰化的C堿基，而甲酰化的C堿基，是可以被亞硫酸氫鹽轉化成U的。
而甲基化的C，不會被轉化成U。這樣就把原來的羥甲基化的C和甲基化的C給區分開來了。
經研究表明，用高釕酸鉀氧化的方法來氧化羥甲基化的C，其轉化效率是94%左右。也就是說，每100個羥甲基化的C中，有94個會被高釕酸鉀轉化成甲酰化的C。并進一步被亞硫酸氫鹽轉化成U。同時，原來的甲基貨攤C，只有2.1%會被轉化成甲酰化的C。
第二鐘區分羥甲基化C的方法，是用糖基把羥甲基化的C給保護起來。然后用TET蛋白（Ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 1），把甲基化的C轉化成羥基化的C。
進一步將羥甲基化的C轉化成甲酰化的C和羧基化的C。甲酰化的C和羧基化的C都可以被亞硫酸氫鹽轉化成U。而之前被糖基化保護起來的羥甲基化的C，是不會被TET蛋白轉化成甲酰化的C或者羧基化的C的。在亞硫酸氫鹽的處理過程中，它還保持是C。并且在之后的PCR擴增產物中，也表現為C。這樣，就可以把羥甲基化的C，和甲基化的C，給區分開來。
用這個方法，沒有甲基化的C，99.6%都被轉化成了U。甲基化的C，97.7%都被轉化成了U。而羥甲基化的C，只有8%被化成了U。也就是說92%的羥甲基化的C得到了糖基的保護，還保持了C。上述，就是目前2個區分羥甲基化的C和甲基化C的方法。
在甲基化文庫建程當中，亞硫酸氫鹽對未甲基化的C的轉化效率并不是100%，一般是在99%左右。為了對實驗的轉化效率進行質量控制。一般會在轉化實驗當中加入內參對照品。一般情況下，是用甲基化酶缺陷型的大腸桿菌，所生產出來的完全沒有被甲基化的λ（噬菌體）DNA，或者pUC19（質粒）DNA做內參。來看一次實驗當中C的轉化效率。一般情況下，實驗當中是加入1%的完全沒有甲基化的λ DNA做內參。
同樣道理，也可以通過用甲基化酶處理過的，CpG島完全被甲基化的DNA，來跟蹤甲基化DNA對亞硫酸氫鹽轉化的抵抗效果。
最后，我們來談一下，甲基化測序后的數據處理。
因為亞硫酸氫鹽處理過后，絕大部分的C都被轉化成了T。這樣，測出來的序列在和基因組進行對比的時侯，直接對比是對比不上的。為了要進行比對，就要把基因組的堿基做兩種轉變。
第一種轉變是把基因組上所有的C都改到T，再來和測序測到的序列來對比。這樣，就可以把原來的鏈給對比上。
第二種轉變，是把基因組上所有的G都變成A，這樣才能和經過PCR得到的原樣本鏈睥互補鏈對比得上。這樣做的原因，是原樣本鏈的互被鏈，它上面絕大部分的G，都被變成了A。所以，只有把（參考）基因組上的G，也都改成A，這樣才能對比得上。比對上之后，再來看哪些堿基是沒有被轉化的。這樣，就可以確認這些堿基的甲基化修飾情況了。
