編譯：謝勇飛，編輯：謝衣、江舜堯。
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酚酸是一種在日常食物攝取中廣泛分布的植物化學物質(zhì)，酚酸參與了多種生理活動，例如養(yǎng)分吸收，酶活性，蛋白質(zhì)合成，光合作用，種子、葉、根和莖的細胞骨架結(jié)構(gòu)，植物酚酸主要通過莽草酸途徑產(chǎn)生，植物中發(fā)現(xiàn)的酚酸的兩個主要類別是C6-C1和C6-C3。C6-C1酚酸具有羥基苯甲酸骨架，包括原兒茶酸、沒食子酸、香蘭素酸、龍膽酸和丁香酸。C6–C3酚酸具有羥基肉桂酸骨架，包括咖啡酸、芥子酸、對香豆酸，鄰香豆酸、阿魏酸和異芥酸。自然界中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)生物活性酚類化合物是復雜的酚酸衍生物，植物中的酚酸以游離、游離的酯以及共軛（結(jié)合）形式呈現(xiàn)。由于酚酸具有抗氧化特性致使酚酸具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎和血管舒張活性等生物學活性。酚酸是一種次生代謝產(chǎn)物，通常在植物源性食物中可以找到，是我們?nèi)粘ｏ嬍车闹匾M成部分。蔬菜、水果作為天然食品，營養(yǎng)豐富，對人體健康具有重要意義。礦物質(zhì)、維生素、抗氧化劑和色素普遍存在于蔬菜中。蔬菜如菠菜、西蘭花和洋蔥富含抗氧化劑，十字花科蔬菜也是天然抗氧化劑的豐富來源，十字花科蔬菜中酚類、生育酚和抗壞血酸含量較高，其中對活性氧損傷具有保護作用。在日本進行的一項研究調(diào)查了8種葉菜類蔬菜的酚酸組成和抗氧化能力。然而，中國研究人員很少對傳統(tǒng)蔬菜的酚酸組成進行深入研究。因此，本研究的結(jié)果可以增進我們對蔬菜酚酸譜的了解，并對食品營養(yǎng)學家和消費者有益。本文使用HPLC-MS對我國常見的44種蔬菜中的這些酚酸進行了定性和定量分析，并對游離可溶性酚酸和結(jié)合不溶性酚酸的分布和濃度進行了測定，測定結(jié)果可作為植物食物營養(yǎng)數(shù)據(jù)庫的補充。
論文ID
原名：Determination of phenolic acid profiles by HPLC-MS in vegetables commonly consumed in China
譯名：HPLC-MS法測定常見蔬菜的酚酸譜
期刊：FOOD CHEMISTRY
IF：5.399
發(fā)表時間：2018年10月13日
通訊作者：陸柏益,劉賢金
通訊作者單位：浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，江蘇省農(nóng)業(yè)科學院食品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所
實驗設(shè)計
本文首先通過蔬菜采集地，蔬菜的消費頻率，不同地區(qū)，季節(jié)蔬菜的生產(chǎn)情況等因素，確定了44種蔬菜，蔬菜樣品隨機從杭州、重慶、廣州、北京、武漢5個城市的大型現(xiàn)代超市和傳統(tǒng)開放市場購買，每種蔬菜至少采集15個樣本，收集了660多份樣品，并將其分為六類：水果、葉、根、花、莖和豆類，采集的同一蔬菜樣品（僅包括可食用部分）均化為混合樣品。冷凍干燥后，44個混合樣品在-80°C下儲存，分析時，首先使用GB/T 134 5009.3-2010標準對樣品含水量進行檢測，游離酚酸樣品制備：從含有0.2%維生素C的20毫升80%甲醇水溶液中提取樣品2 g樣品，在渦流振蕩10秒后，在室溫下對樣品進行30分鐘的超聲波處理，高速離心，將上清液移入50ml容量瓶中，在重復提取之后，混合上清液。分析之前將上清加水至50 mL并通過0.22μm微孔膜。游離酚酸酯樣品的制備：提取過程同游離酚酸樣品制備至高速離心取上清液，之后將上清液移到100毫升梨形燒瓶中。重復提取后，組合上清液減壓濃縮濃縮至至20毫升，將濃縮液移入150 mL錐形瓶中，并用20 mL 4 M氫氧化鈉水溶液處理，并且氮吹，將混合溶液在40℃下在氣浴中水解2 h，搖動并避光。通過添加4 M鹽酸水溶液，將pH值調(diào)整為2。將混合液與20毫升正己烷在室溫下?lián)u動20分鐘，然后去除正己烷層。接著40mL乙酸乙酯提取水層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在35℃下將混合提取物濃縮至幾乎干燥，殘渣溶解在10毫升50%甲醇/水中，通過0.22μm微孔膜。結(jié)合酚酸分析用樣品的制備：同游離酚酸酯樣品的制備。HPLC–MS 分析：用安捷倫1260系列高效液相色譜儀對酚酸提取物進行了分析，在反向C18柱上進行分離，溫度保持45℃，A相乙腈，B相0.1%水甲酸溶液，以0.25毫升/分鐘的流速泵送，總運行時間為20分鐘，注射量為5μL。濃度梯度如下，0%–5% A持續(xù)1分鐘，5%–13%A持續(xù)1分鐘，13%–184 15%A持續(xù)4分鐘，15%–21%A持續(xù)1.5分鐘，21%A持續(xù)1分鐘，21%–27%A持續(xù)1分鐘，27%–50%A持續(xù)2.5分鐘，50%A持續(xù)1分鐘，50%–5%A持續(xù)1分鐘，5%A持續(xù)6分鐘。使用ESI的質(zhì)譜（QTRAP 6500，AB Sciex, Framingham, USA）同時進行多反應(yīng)監(jiān)測，并進行正負離子模式掃描，ESI條件如下：4400和-4400 V之間的離子噴射電壓，溫度：400°C，幕式氮氣:30 psi,碰撞氣體：氮氣，15psi，霧化器氣體：空氣，60psi,和加熱器氣體：空氣，65 psi，使用Analyst 1.5.1版軟件進行數(shù)據(jù)采集和處理。統(tǒng)計分析：至少15種蔬菜中制備的混合樣品的以三種方法對酚酸水平進行測量，采用SPSS 20.0軟件進行分析。
實驗結(jié)果
1.高效液相色譜-質(zhì)譜法方法的優(yōu)化與驗證
首先對17種酚酸進行了表征，以確定其前體離子，并為MRM 選擇產(chǎn)物離子，考慮到全掃描質(zhì)譜中優(yōu)勢離子的靈敏度和重現(xiàn)性，我們選擇了17種酚酸的負模式。基于分析的峰面積優(yōu)化了HPLC-MS 參數(shù)以最小化基質(zhì)效應(yīng)并提高總靈敏度，參數(shù)包括毛細管電壓、去聚集電位、碰撞能和保留時間，優(yōu)化參數(shù)見表1，
蔬菜中含有17種酚酸的標準品和質(zhì)譜進行了比對，通過測量六種濃度的標準溶液制備每種化合物的校準曲線，在進行HPLC-MS分析之前，通過在樣品中加入極低濃度的分析物來確定分析方法的限值，計算了檢測限，結(jié)果顯示，校正曲線在0.005-50.0mg/L濃度范圍內(nèi)呈線性趨勢，相關(guān)系數(shù)良好（R2>0.990）。LOD值在0.008-0.042mg/L范圍內(nèi)，日內(nèi)和日間相對標準偏差分別低于6.4%和6.2%。現(xiàn)行方法的靈敏度明顯高于以往報道的方法。高效液相色譜質(zhì)譜法也能比以前報道的方法檢測更多的蔬菜中的酚酸，將蔬菜樣品（2.0g）分別加入1.0和5.0mg/L 的酚類標準品，測定回收率。提取加標樣品，然后用改進的方法進行分析。每個實驗在每個級別重復6次，濃度水平和詳細結(jié)果見表2。回收率在71.0%-110.7%之間，RSD在2.05%-9.98%之間。
表1 44種蔬菜中17種酚酸的組成和含量
表2 蔬菜中17種酚酸的線性回歸、LOD和回收率
2.44種蔬菜酚酸譜的研究
采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定了我國常見的44種蔬菜中17種主要酚酸的含量和組成（圖1），6大類蔬菜中17種酚酸的平均濃度順序如下：花（64.39μg/g 鮮凍重[FW]）>根（56.68μg/g fw）>葉（53.44μg/g fw）>莖（48.07μg/g fw）>豆類（20.83μg/g fw）>水果（16.92μg/g fw），此外酚酸蔬菜中的種類分布如圖2所示。葉菜（17種）、根菜（17種）、莖菜（17種）的酚酸含量均高于豆類（3-10種）、水果（12-13種）、花卉（9-10種）。結(jié)果還表明，酚酸在不同蔬菜品種中的分布變化。蕓苔科、百合科、菊科、葫蘆科和茄科蔬菜中檢測到的酚酸有10種以上，豆科蔬菜中檢測到的酚酸有4-10種。不同種類蔬菜的酚酸濃度和比例有差異，同一蔬菜不同組織中酚酸含量存在顯著差異。
圖1 44種蔬菜中17種酚酸的組成和濃度
對主要酚酸進行了定量分析。阿魏酸和芥子酸（44種蔬菜中檢出）、沒食子酸（43種蔬菜中檢出）、咖啡酸（41種蔬菜中檢出）和對羥基苯甲酸（40種蔬菜中檢出）在蔬菜中廣泛存在。僅在24種蔬菜中檢測到3,5-二羥基苯甲酸、2-羥基肉桂酸和3-羥基肉桂。聚類分析表明，阿魏酸（101.99-884.68μg/g干重[DW]）、異芥酸（24.81-660.41μg/g DW）和p257香豆酸（9.27-67.41μg/g DW）的含量高于其它酚酸，并且主要存在于葉菜類蔬菜中。
咖啡酸由于其芳香環(huán)上的3,4-二羥基化作用而具有比對香豆酸更高的抗氧化活性。在目前的研究中，咖啡酸和對香豆酸在這些蔬菜中被廣泛檢測到。本研究發(fā)現(xiàn)，萵苣中咖啡酸含量最高（77.91 μg/g DW）。紫甘藍中對香豆酸含量最高（671.41μg/g DW）。甘蔗莖中阿魏酸含量極高，為（660.41μg/g DW），比排名最低的蔬菜南瓜 (2.79 μg/g DW)約高237倍，在蔬菜樣品中，綠蘿卜的異芥酸（884.68μg/g DW）和紫甘藍（609.96μg/gdw）的芥酸含量最高。結(jié)果表明，蘿卜、紫甘藍、萵苣等蔬菜可能是酚酸的良好來源。不同種類蔬菜中各種營養(yǎng)素和抗氧化劑的含量差異很大，導致不同蔬菜的抗氧化能力不同。同時，同一種類的不同蔬菜可能表現(xiàn)出不同的抗氧化活性。
3.44種蔬菜中游離酚酸和結(jié)合酚酸的分布
酚酸對蔬菜品質(zhì)和人體健康的影響不僅取決于酚酸的種類和數(shù)量，而且還取決于底物中存在的形式。圖2顯示了44種蔬菜中的游離（游離和游離酯）和結(jié)合酚酸的分布。紫甘藍可溶性酚酸含量最高（121.42μg/g FW），蓮藕最低（0.82μg/g FW）。紫甘藍中不溶性酚酸含量最高（31.31μg/g FW），冬瓜最低（0.01μg/g FW）。6組蔬菜中含量差異有顯著性（P<0.001）。除莖類蔬菜（P<0.027）外，游離可溶性酚酸在蔬菜中占優(yōu)勢（P<0.1）。水果（P<0.020）、豆類（P<0.001）和葉菜類（P<0.001）中幾乎所有的酚酸都是少量結(jié)合的不溶性酚酸的基礎(chǔ)上自由溶解的結(jié)合酚酸，在細胞壁中起著重要的作用，它提供物理和化學屏障，防止病原體入侵，收斂，阻止昆蟲、動物、細菌和真菌的攻擊；此外，結(jié)合酚酸還具有抗氧化功能。不溶性結(jié)合酚酸在消化后能在胃腸中存活，并能到達結(jié)腸，這是由于細胞壁纖維材料的消化率較低，紫甘藍中總酚（152.73μg/g FW）和結(jié)合酚酸（77.36307μg/g FW）含量最高，這些值高于先前報告的值。這種差異可能是由于使用的檢測方法。然而，在深色蔬菜（紫甘藍和西蘭花）中發(fā)現(xiàn)的酚酸的濃度明顯高于其他蔬菜中；因此，深色蔬菜比淺色蔬菜表現(xiàn)出更強的抗氧化能力。酚酸之間沒有協(xié)同作用，使用含2，2'-疊氮雙（3-乙基苯并噻唑啉）的總抗氧化能力測定試劑盒僅觀察到添加作用。
圖2 （a) 濃度和 (b)6種蔬菜中游離和結(jié)合酚的比較。
4. 羥基苯甲酸和羥基肉桂酸在44種蔬菜中的分布
根據(jù)側(cè)鏈酚環(huán)上的碳原子數(shù)，我們可以將酚酸分為C6-C3和C6-C1化合物，它們分別來自羥基肉桂酸和羥基苯甲酸，盡管具有相同的基本骨架，酚酸類芳香環(huán)上羥基的數(shù)目和位置是不同的。不同蔬菜含有羥基肉桂酸和羥基苯甲酸（圖3），羥基肉桂酸由苯丙氨酸生物合成，是植物中分布最廣的酚酸。17種酚酸中，羥基肉桂酸8種，羥基苯甲酸9種，試驗蔬菜中羥基肉桂酸和羥基苯甲酸的含量分別為0.66-149.87和0.35-54.31μg/g FW。除胡蘿卜、豆芽和花椰菜外，大多數(shù)蔬菜中羥基肉桂酸的含量均高于羥基苯甲酸（P <0.001）。紫甘藍中羥基肉桂酸含量最高，約為最蔬菜冬瓜的230倍。豆芽中羥基苯甲酸的含量最高，比排名最低的蔬菜雪豆高出約160倍。蔬菜中羥基肉桂酸和羥基苯甲酸的總濃度存在一定的差異。
圖3。（a）濃度和（b） 6種蔬菜中羥基肉桂酸和19-羥基苯甲酸的比較
結(jié)語
本文建立了一種靈敏可靠的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，用于蔬菜基質(zhì)中17種酚酸的快速定性和定量分析。檢出限為0.008mg/L～0.042mg/L，平均回收率為71.0%～110.7%，RSD≤9.98%。該方法的靈敏度比以往報道的方法高，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）法測定了我國常見蔬菜中17種酚酸的含量。六種蔬菜中總酚酸的平均濃度順序如下：花（64.39μg/g FW）>根（56.68μg/g FW）>葉（53.44μg/g FW）>莖（48.07μg/g FW）>豆（20.83μg/g FW）>果（16.92μg/g FW）。酚酸在葉菜類（17種）、根類（17種）、莖類（17種）蔬菜中的分布比在豆類（3-10種）、水果（12-13種）和花（9-10種）中的分布更為豐富，在蕓苔科、百合科、菊科、葫蘆科、茄科蔬菜中檢測到10多種酚酸，而在豆科蔬菜中僅檢測到4-10種酚酸。阿魏酸和芥子酸（44種蔬菜中檢出）、沒食子酸（43種蔬菜中檢出）、咖啡酸（41種蔬菜中檢出）、對羥基苯甲酸（40種蔬菜中檢出）。阿魏酸（101.99-884.68dw）、異芥酸393（24.81-660.41μg/g DW）和對香豆酸（9.27-67.41μg/g DW）的含量均高于其他酚酸，主要存在于葉菜類蔬菜中。除莖類蔬菜（P<0.027）外，其余蔬菜均以游離酚酸為主（P<0.001）。水果（P<0.100）、豆類（P<0.001）和葉菜類（P<0.001）中幾乎所有酚酸都是游離的。在所有的樣本中羥基肉桂酸濃度為0.66-149.87μg/g，羥基苯甲酸總濃度為0.35-54.31μg/g。除胡蘿卜、豆芽和花椰菜外，大多數(shù)蔬菜中羥基肉桂酸的含量比羥基苯甲酸高（P<0.001）。
花、葉和根類蔬菜富含天然抗氧化劑，酚酸濃度與蔬菜的總抗氧化能力有關(guān)。因此，蔬菜可作為預(yù)防氧化應(yīng)激所致疾病的重要膳食來源。這項研究的結(jié)果有望為膳食指南和流行病學研究提供有力的支持。進一步研究這些蔬菜中酚酸的代謝和生物利用度是有必要的。
