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1.樣本來源：招募了6名中國人類受試者，其中包括來自廣西桂林市的3名肥胖成年受試者和3名正常成年受試者。選定的參與者經歷了相同的環境因素，具有相似的衛生狀況、飲食、污染和其他常見的生活方式特征。

2.肥胖成年人模型的評估：通過測量體重指數（BMI）了解受試者的肥胖狀況，BMI18.5至<25代表正常，而BMI≥30.0則代表肥胖，同時采集正常和肥胖成年人的血液，并通過生化試驗、酶聯免疫吸附試劑盒測量樣本中與肥胖有關的各種參數和標記，包括血漿胰島素、成纖維細胞生長因子21、白細胞介素10、血漿中谷氨酸丙酮酸轉氨酶（ALT），甘油三酸酯，總膽固醇（TC），低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的水平。使用HOMA計算胰島素抵抗（IR），公式為：HOMA =空腹血糖（nmol/ l）×胰島素（μU/ ml）/22.5。通過穩態模型評估（HOMA-IR）指數評估接受測試的肥胖成年人模型。

3.16SrRNA分析：提取正常和肥胖成年人的糞便細菌進行了16S rRNA分析，了解肥胖成年人的腸道微生物組成變化。

4.糞便、血清代謝組分析：對正常和肥胖成年人的糞便、血清樣本分別進行代謝組研究，對獲得的代謝組學數據進行綜合分析，了解腸道菌群和腸道宿主代謝物譜之間的相關性。

1. 正常和肥胖成年人的血液參數

本研究使用BMI作為超重或肥胖的篩查工具，了解研究中肥胖成年人的狀況并測量了受試者的BMI，檢測了其血液樣本中與肥胖有關的各種參數和標記（見表1）。BMI為18.5至<25代表正常，而BMI≥30.0則代表肥胖。并通過HOMA-IR指數對肥胖成年人模型進行評估，包括甘油三酸酯水平， LDL-C，HDL-C，空腹血糖（FBG），胰島素，ALT和TC（表1）等。

結果顯示，肥胖組的HOMA IR指數高達5.66±0.78，表明受測肥胖成年人的胰島素抵抗顯著（表1）。此外，肥胖組的LDL-C和TC含量較高，而HDL-C的含量較低（表1），進一步表明接受測試的肥胖成年人患心血管疾病的風險較高。這些數據表明接受測試的肥胖成年人是良好的研究模型。

表1 正常成年人與肥胖成年人的肥胖參數

2. 肥胖成人腸道微生物群的變化

為了了解肥胖成年人腸道微生物的組成變化，對正常和肥胖成年人的糞便樣本進行了16S rRNA分析，每個樣品中至少獲得了1700萬有效堿基，并使用操作分類單位（OTU）對微生物多樣性進行分類。正常組（圖1A）中識別了1035個OTU，肥胖組（圖1B）中識別了989個OTU，其中兩個組中共有862個OTU（圖1C）。α多樣性分析通過觀測物種指數、Chao1指數、Shannon指數和Simpson指數對各樣本物種多樣性的復雜性進行分析。稀疏曲線的平展表明測序數據覆蓋群落中的所有細菌種類（圖1D）。然而，在正常成年人和肥胖成年人之間，腸道細菌種類多樣性的差異不顯著（圖1D）。但對正常成人和肥胖成年人糞便微生物群落的比較分析表明，肥胖成年人的梭菌類顯著減少（表2）。此外，在肥胖的成年人的腸道中變形菌類、理研菌科、巴斯德氏菌科（圖2A、B和表2）、Alistipes和嗜血桿菌屬（圖2C和表2）等微生物群落均存在一定程度地減少。并且在種屬水平上，與正常成年人相比，肥胖成年人中的Allopretella、毛螺菌科、嗜膽菌屬和Burkholderales存在顯著富集(圖2C和表2)。通過重建未觀察到的狀態（PICRUSt）進行系統發育研究來預測肥胖成年人中觀察到的微生物組變化的潛在功能作用，PICRUSt分析表明糖酵解(糖酵解I （P= 0.044）、糖酵解II（P= 0.02））、三羧酸（TCA）循環（P= 0.031）和同乳酸發酵（P= 0.04）發生功能改變(表3)。

圖1 不同分組的腸道微生物菌群多樣性

A：正常成年人常見的OUT；B：肥胖成年人常見的OUT；C：正常和肥胖成年人常見的OUT；D：Alpha多樣性分析，包括物種觀察、Chao1、Shannon和Simpson指數。

圖2 肥胖成年人與正常成年人腸道菌群的變化

不同分組樣本在（A）目、（B）科、（C）屬水平上的分類組成

表2 肥胖成年人腸道微生物群的顯著變化

3. 糞便代謝組變化

基于LC-MS的代謝組學方法，肥胖成年人代謝組學分析獲得了14610個具有正離子模式（PIM）和12540個負離子模式（NIM）的代謝物（表4），使用人體代謝組數據庫（HMDB）對獲得的數據進行分析，分別注釋了7370個具有PIM特征、5468個具有NIM特征的樣本（表4）。在HMDB超類分析中，PIM（圖3A）和NIM（圖3B）中含量最高的代謝產物為脂質分子，肥胖和正常成年人糞便代謝產物具有明顯的差異（圖3C）。在MS1分析中，肥胖成年人與正常成年人相比， PIM鑒定出1913個異常代謝物（797上調和1116個下調的代謝物）（圖3D和表2），NIM鑒定出1288個異常的代謝物（532上調和756個表達下調代謝物)）（圖3E和表3）。

圖3 肥胖成年人與正常成年人腸道代謝物的變化

A、B：糞便代謝物中鑒定的PIM和 NIM；C：肥胖成年人與正常成年人糞便代謝組中PIM和NIM的差異代謝物；D、E：正常成年人與肥胖成年人糞便中PIM和NIM差異代謝物的火山圖

表3  PICRUSt分析微生物菌群變化引起的功能改變

表4 糞便代謝組的統計分析

為了闡明糞便代謝物的改變與肥胖成年人代謝紊亂之間的相關性，通過KEGG通路富集分析肥胖成年人代謝通路與次生代謝物生物合成之間的密切聯系。KEGG通路分析顯示，在肥胖成人中，代謝通路與次生代謝物的生物合成密切相關（圖4A）。受影響的代謝途徑包括組氨酸代謝、苯丙氨酸代謝和脂肪酸代謝（圖4A）。其中多種脂肪酸代謝通路顯著富集，如花生四烯酸代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、脂肪酸延伸和降解（圖4B）。此外，肥胖成人糞便中的葡萄糖代謝，包括半乳糖、果糖、甘露糖、淀粉和蔗糖代謝也發生了改變（圖4B）。總的來說，這些數據與肥胖成年人腸道菌群的變化一致。

圖4 肥胖成年人腸道代謝紊亂的功能分析

A：肥胖成年人糞便代謝組的KEGG富集散點圖；B：肥胖成年人中PIM和NIM差異代謝物的數量

4. 肥胖成年人的血清代謝變化

血清比較代謝組學分析結果顯示，正常成年人與肥胖成年人的血清代謝組獲得12419個PIM和14134個NIM的代謝物（表5）。MS1分析中確定了6354和5452個獨立樣本分別屬于PIM和NIM （表5），在HMDB超類分析中，含量最高的代謝物是PIM（圖5A）和NIM（圖5B）中的脂質分子。此外，肥胖和正常成年人之間的血清代謝產物圖譜比較顯示出顯著差異(圖5C)。PIM鑒定出384個異常代謝產物（包括127個上調和257個下調）（圖5D），而NIM鑒定出498個異常代謝產物（包括339個上調和159個下調）（圖5E）。對異常代謝產物進行KEGG通路富集分析，與糞便代謝組學分析一樣，肥胖成年人體內的代謝通路也發生了改變（圖5F），表明腸道微生物代謝產物與宿主血清代謝產物之間可能存在相互作用。另外，初級膽汁酸的生物合成、花生四烯酸代謝和產生IgA的腸道免疫網絡也受到干擾（圖5F）。

表5  血清代謝組的統計分析

圖5 肥胖成年人與正常成年人血清代謝物的變化

A、B：血清代謝物中鑒定的PIM和NIM；C：肥胖成年人與正常成年人血清代謝組中PIM和NIM的差異代謝物；D、E：正常成年人與肥胖成年人血清代謝組中PIM和NIM差異代謝物的火山圖；F：肥胖成年人血清代謝組的KEGG富集散點圖

5. 糞便、血清的綜合代謝組學分析

對糞便和血清樣本中獲得的代謝組學數據進行了綜合分析，以了解腸道微生物群和腸道-宿主代謝產物譜之間的相關性。確定了肥胖病人的糞便和血清樣本中的25個異常表達的代謝物，包括11個上調和14個下調代謝物（表6），如l-苯丙氨酸，酪氨酸，尿酸，犬尿酸、膽固醇硫酸氨基葡萄糖等。結果表明肥胖成年人的血清和糞便代謝產物存在一致的失調，而這些失調與腸道微生物群的改變所導致的功能改變一致。

表6 肥胖成年人血清和糞便樣本中的差異代謝物

腸道微生物群組成和功能的改變是代謝損傷的特征之一。在人類和動物模型中進行的多項研究表明，腸道菌群對各種代謝特征和功能障礙（如肥胖和胰島素抵抗）有重要影響。腸道微生物群可以將淀粉發酵成具有生物活性的代謝物，包括SCFAs，如乙酸、丁酸鹽等。代謝疾病可由能量攝入和消耗之間的不平衡引起。流行病學和實驗室研究報告顯示，腸道微生物依賴代謝物的能量收集作用，如短鏈脂肪酸（SCFAs），與代謝綜合征的發展密切相關。因此，腸道代謝物被認為是連接腸道微生物群與代謝綜合征的主要成分。盡管已知腸道菌群對宿主代謝產物水平的影響，但肥胖個體腸道菌群、腸道代謝產物與宿主代謝之間可能存在的相關性仍是有限的。

1. 16SrRNA分析

在本研究中，16SrRNA分析發現肥胖成人的梭菌類顯著減少，變形菌類、理研菌科、巴斯德氏菌科、Alistipes和嗜血桿菌屬等微生物群落也存在不同程度的減少。梭菌類包含約250種細菌，是腸道微生物的重要組成，梭菌的定植可促進腸道吸收脂肪，減少肥胖；而變形菌作為一種革蘭氏陰性細菌，主要包含硫酸鹽還原菌，是一種人類腸道菌群中的主要細菌，在大鼠和克羅恩氏病中，高脂飲食已顯示會改變其豐度，從而暗示其在代謝異常存在一定作用；理研菌科細菌存在多種不同動物的消化道中，已研究表明肥胖成年人與正常成年人相比，其理研菌科和巴斯德氏菌科細菌的豐度較低，而理研菌科的相對豐度降低與鈣衛蛋白水平有關，并且可導致嗜中性粒細胞向腸粘膜遷移，因此，其豐度降低可能與結腸炎癥相關。

而PICRUSt分析預測，糖酵解、TCA發生功能改變。糖酵解和三氯乙酸循環是葡萄糖穩態的重要生物學過程和能源支出。糖酵解主要調節胰島素分泌和多種細胞的功能代謝，尤其是肝細胞，并且糖酵解的改變與肥胖相關，已有研究表明肝糖酵解的增強可減少肥胖小鼠的體重，緩解肥胖；而在高脂飲食小鼠模型中，其肝臟TCA循環（末端脂肪氧化和糖異生）升高，在誘導肥胖小鼠的白色脂肪組織中，TCA循環的代謝物增加。在本研究中，肥胖成年人的腸道菌群中TCA循環代謝物水平降低，導致差異的原因可能是由于肥胖患者中TCA循環酶的失調。綜上所述，這些數據均提示肥胖成年人腸道菌群的改變可能與宿主代謝的改變有關。

2. 糞便代謝組分析

在HMDB超類分析中，PIM和NIM含量最高的代謝產物為脂質分子，而KEGG通路分析顯示，在肥胖成人中，受影響的代謝途徑主要包括組氨酸代謝、苯丙氨酸代謝和脂肪酸代謝，其中多種脂肪酸代謝通路顯著富集。

糞便樣本中存在脂質或脂肪可能是由于腸道微生物群產生的SCFAs被腸道吸收，經糞便排泄。SCFA的大量排泄與多種健康問題相關，如過度肥胖和代謝疾病。而組氨酸是一種主要從日常攝入的蛋白質中獲得的氨基酸，可用于代謝能生產，約占代謝能生產的15%，而另一方面，組氨酸還可以通過糖異生來生產葡萄糖。因此，組氨酸代謝的改變可能導致能量和葡萄糖穩態的失衡。苯丙氨酸作為一種必需氨基酸，可通過苯丙氨酸羥化酶轉化為酪氨酸，而血清苯丙氨酸水平與肥胖顯著相關，其中苯丙氨酸與高甘油三酯血癥風險的相關性較高。

3. 血清代謝組分析

對正常成年人與肥胖成年人的血清代謝組進行比較分析，肥胖成年人除了體內的代謝通路發生改變，其初級膽汁酸的生物合成、花生四烯酸代謝和產生IgA的腸道免疫網絡也受到干擾。膽汁酸是在肝臟中合成的甾體酸，參與脂肪代謝，如脂肪的消化和吸收；膽汁轉移與腸道微生物群的變化有關，并可通過改善血糖和脂質穩態顯著減輕體重；此外，花生四烯酸是一種多不飽和脂肪酸，存在于質膜的磷脂中，在營養代謝中發揮作用，從而參與代謝疾病如肥胖和糖尿病的發展，并且已有研究表明脂肪組織花生四烯酸與BMI和超重狀況之間存在正相關關系。

4. 綜合代謝組學分析

對糞便和血清樣本中獲得的代謝組學數據進行了綜合分析，確定了肥胖病人的糞便和血清樣本中的25個異常表達的代謝物，包括l-苯丙氨酸，酪氨酸，尿酸、膽固醇硫酸氨基葡萄糖等。l-苯丙氨酸參與能量攝入，補充苯丙氨酸可促進全身脂肪氧化，調節腸道激素釋放；而l-酪氨酸與人類的肥胖、胰島素抵抗有關；尿酸是尿液的主要成分，血清尿酸水平是評價肥胖、糖尿病等代謝紊亂的一個指標，也是代謝綜合征、糖尿病和高血壓的重要生物標志物，尿酸水平高的人更容易患代謝綜合征和糖尿病；此外，有研究證實了膽固醇硫酸鹽、葡萄糖胺和腎上腺酸與肥胖的相關性，膽固醇硫酸酯通過抑制乙酰輔酶A合成酶的表達來抑制糖異生，葡萄糖胺在臨床上可用于抗炎、清除自由基和抗肥胖。

目前的大多數研究僅針對肥胖者的腸道微生物代謝物或血清代謝物，但沒有系統的研究報告腸道微生物代謝物與宿主血清代謝物之間可能的關聯。盡管本研究中發現的血清和糞便代謝產物之間的因果關系還需要通過無菌小鼠模型進一步證實。但本文為這種重要的相關性研究提供了一種新穎的見解。本研究中發現的腸道微生物組和腸道宿主代謝物的失調，可以通過更大的肥胖患者樣本量進一步證實，從而得出結論。綜上所述，本研究通過腸道代謝物的變化來評估腸道菌群對宿主代謝物的可能影響，揭示腸道菌群的變化可能影響腸道和宿主的代謝物，導致肥胖、糖尿病等代謝紊亂。這項研究的發現，列舉代謝物的變化，可以擴大作為生物標志物的肥胖和代謝紊亂。