編譯：彭翰林，編輯：Tracy、江舜堯。
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肺動脈高壓（PAH）的特征是進行性的閉塞性血管重塑導致的右心負荷增加。最初右心室（RV）會通過增加其壁厚來適應該改變（適應表型），但PAH的進一步發展通常會引起RV增大和衰竭（適應不良表型），從而導致需要進行肺移植甚至死亡。從適應性RV向適應不良性RV過渡的病理生理學機制尚未得到很好的闡明，部分原因是很少有PAH相關研究關注在右心適應不良表型（RHMP）的標志物上。以RV為中心的模型的預后價值等同于REVEAL評分（REVEAL評分是一種廣泛采用的PAH風險分層工具，需要更廣泛的臨床數據和侵入性血流動力學措施），基于這些右心評分，我們的主要目標是鑒定PAH中RHMP的新型循環蛋白質組學生物標志物。我們假設PAH患者可能表達與RHMP相關的特定的血液蛋白質組，而與肺部疾病的嚴重程度無關，我們還想檢查RHMP蛋白質組學標記物與生存的關系，尋求評估末期PAH患者的RV樣品中RHMP標記的組織水平表達以及RV壓力超負荷的實驗小鼠模型，以檢驗循環水平升高反映RV過表達的假說，并驗證用于未來機理研究的肺動脈束帶模型（PAB）。
論文ID
實驗設計
（1）PAH隊列和對照隊列的蛋白組學分析
（2）Standford和Mayo評分鑒定蛋白標記物和RHMP之間的關系
（3）對照組和PAB小鼠的生物標記物表達水平鑒定
實驗結果
1.PAH患者RHMP的蛋白質組學分析
表1總結了發現隊列的基線特征，包括以下幾個方面：高水平的肝生長因子（HGF），干細胞生長因子（SCGFβ或CLEC11A），神經生長因子（NGF）和基質細胞衍生因子1（SDF1或CXCL12）；更高的Mayo和Stanford評分；同時伴有RV相關功能障礙（RVLS），RV不良重塑（RVESRI），更高的NT-proBNP和較差的NYHA功能類別（圖1A）。
驗證隊列中的女性比例比發現隊列中的女性比例更高，肺部疾病特征更嚴重，接受背景治療的患者更少，發生事件的頻率更高（表1）。在兩個隊列中，REVEAL，Mayo和Stanford的風險評分分布相似。高水平的HGF，SCGFβ，NGF和較小程度的SDF1、較高風險的Mayo和Stanford評分、RV功能障礙、較高的NT-proBNP和較差的NYHA功能類別相關，但與肺部疾病嚴重程度無關（圖1A）。我們在兩個隊列中均未發現測量的細胞因子與良好的右心指標呈正相關。
圖1B-C比較了在這兩個隊列里低，中和高風險RV患者亞組與88位健康對照的4種候選RHMP標記水平。
圖1（a）隊列中每種細胞因子的重要性分數（VIP）和相關性與右心得分和指標的相關性。使用偏最小二乘回歸評估了血漿蛋白質組學標記（使用多重免疫測定）和右心適應不良表型，在121位PAH患者（2008-2011年的發現隊列）和76位（2012-2014年的驗證隊列）中進行。正相關以紅色顯示，負相關以藍色顯示。（b）根據右心適應不良表型的水平，鑒定肺動脈高壓（PAH）和對照組中四種標記物的水平。根據Stanford RH評分（上圖）或Mayo RH評分（下圖）的三分位數，分析PAH患者和88位健康對照者與右心適應不良表型相關的4種PHMP生物標志物的水平。
表1 發現和驗證隊列的基線比較特征
值表示為平均值±SD或數字（百分比），或中位數和四分位數范圍（IQ）。顯著的p值（<0.05）以粗體顯示。RVSP是根據194個患者（85％的患者）的TR信號估算得出的。NYHA：紐約心臟協會；PAH：肺動脈高壓；RV：右心室；RVESAI：在體表面積上索引的RV舒張末期面積：RVFAC：面積變化分數；RVLS：自由壁縱向應變；RVSP：右心室收縮壓；TAPSE：三尖瓣環平面收縮期偏移
2.HGF的預后價值
在3.14年，有76例患者達到了主要終點（住院58例，移植了10例，總共41例死亡）。主要終點的無事件生存率（±標準誤差）在1年時為91±2％，在3年時為78±3％，在5年時為62±34％（圖2A），而49位患者達到了死亡或移植的次要終點。使用單變量分析，HGF和SCGFβ與主要終點相關，而NGF和SDF1a沒有關系。根據HGF（p<0.001）和SCGFβ四分位數（p = 0.002）得出的主要終點的Kaplan-Meier生存曲線如圖2B所示，在Mayo，Stanford和REVEAL評分中增加了HGF顯著的增值，以預測3年時的主要終點（p <0.01，圖2C），HGF和SCGFβ均與死亡或移植的次要終點有關。
圖2 肝生長因子（HGF）的預后價值及其對進行結局預測的風險評分的增量值
（a）主要合并終點的五年KaplanMeier生存曲線（n = 197）；（b）根據基線時HGF水平的四分位數；（c）Cox回歸分析。
3.缺乏心臟縱向重構的生物標志物
在總人群中，有174例患者在1年后接受了超聲心電圖檢查。無論研究期間是否開始治療，基線時的4種RHMP生物標志物均未發現與右心重塑的改變有關；同樣，基線時的Stanford評分，Mayo評分和NTproBNP與隨訪時右心重塑的改變無關。
4.RHMP生物標志物在人RV組織中的表達
在PAH患者的RV標本中，HGF及其受體c-Met的蛋白質水平高于對照組（圖3）。與對照組相比，PAH中的NGF含量降低，其受體TRKA表達升高。
在PAH患者中，通過Picro-Sirius Red染色面積百分比評估的RV纖維化水平為11.5％，在PAH病因學方面相似。圖3顯示了特發性PAH患者的RV樣品中4種生物標志物和受體的定位，兩名PAH患者（特發性和BMPR2突變）均顯示相似的蛋白RV表達。c-Met與心肌細胞，平滑肌細胞，內皮細胞和成纖維細胞標志物共定位，在較小程度上與巨噬細胞共定位。HGF呈點狀表達，呈囊泡狀，在心肌細胞，平滑肌細胞和成纖維細胞中含量較高，在巨噬細胞和巨噬細胞中含量較低。TRKA和NGF均與心肌細胞，平滑肌細胞和巨噬細胞共定位，而TRKA另外與成纖維細胞共定位，而NGF與內皮細胞共定位（圖3）。SCGFβ存在于心肌細胞，平滑肌細胞和成纖維細胞中，而SDF1在心肌細胞，平滑肌細胞，內皮細胞和巨噬細胞中存在。
圖3 c-Met（A，紅色）及其配體HGF（B，紅色）在特發性肺動脈高壓患者的右心室活檢中通過免疫染色的定位
5.PAB小鼠中生長因子Hgf，c-Met，Ngf和Scgfβ的RV表達改變
與對照組相比，PAB RV勻漿中Hgf，c-Met和Ngf的RNA表達顯著增加，而Sggβ的表達顯著降低（圖4）。
圖4 在肺動脈帶狀小鼠的RV中，與對照相比，HGF，c-Met，NGF和SCGFb的基因表達
討論
先前的PAH蛋白質組學研究發現了與肺血管疾病嚴重程度和預后相關的血液特征，該研究利用無監督的機器學習來識別具有明顯炎癥特征的PAH表型。現在越來越多的證據表明，PAH患者的炎癥和RV衰竭與實驗性疾病模型之間存在關聯，但是之前的蛋白質組學篩查研究都沒有以右心為中心。最近的影像學研究已大大改善了PAH的右心適應性表型的鑒定，將RV自由壁縱向應變（RVLS）和收縮末期尺寸（例如重塑指數RVESRI）確定為RV適應性的強心動圖標記。這些標記均已與紐約心臟協會（NYHA）功能類別和N端前B型利尿鈉肽（NT-proBNP）整合在一起，以定義RHMP得分（Mayo診斷模型：基于RVLS，NYHA類和NT-proBNP；斯坦福診斷模型：RVESRI，NYHA類和NT-proBNP）。本研究運用具有針對性的蛋白質組學研究確定了與RHMP相關的四種循環細胞因子，并證明與肺血液動力學的嚴重性無關。HGF在3年時可作為臨床惡化的有力預測指標，并增加到REVEAL評分中。PAH患者的RV在心肌細胞，平滑肌細胞和內皮細胞中的cMet和HGF蛋白表達增加，PAB小鼠模型進一步證實了Hgf和c-Met的基因表達增加，這表明PAB是進一步研究RV對PAH的適應性相關的有效模型，并解答了增加HGF表達是有利或有害的問題，這種方法使我們將血液用作PAH右心衰竭的窗口，從而將HGF /c-Met鑒定為感興趣的潛在信號通路。
HGF是一種間充質來源的多效性細胞因子，與它的酪氨酸激酶受體c-Met結合。HGF /c-Met信號通路可促進血管生成，心肌細胞存活并抑制實驗性心肌梗塞和左心肌病模型的纖維化和血管通透性以及炎癥。盡管HGF對左心有心臟保護作用，但一些研究反常地報道了HGF的高循環水平與幾種壓力超負荷的心臟病（高血壓和主動脈瓣狹窄）或晚期缺血的左心室重塑，功能障礙等相關。
關于HGF /c-Met在右心臟中的分子作用的證據很少。據報道，在小群患有硬皮病相關性或特發性PAH且HGF與MPAP相關的患者中，HGF水平較高，我們的研究進一步證明了高血漿HGF水平與RHMP的相關性超出了肺部疾病的嚴重程度。在納入人口統計學、患病率/發病率以及功能嚴重性方面不同的兩個隊列之后我們進一步證明了所鑒定的生物標志物與跨PAH病因的RV適應性相關。高HGF水平與我們隊列中的結局密切相關，為REVEAL風險評分增加了增值，暗示HGF /c-Met軸在右心臟的作用。四種RHMP生物標志物均與基線時右心評分或NT-proBNP水平（經驗證的預后標志物）無關聯，與右心重塑的改善無關，這說明了預后標志物對治療的反應。未來的研究應調查從基線到1年生物標志物水平的變化是否與右心重塑的變化相關。
雖然PAH中HGF血漿水平升高的起源仍有待充分闡明，但我們報道了HGF和c-Met的蛋白表達在PAH患者中增加，另一個發現是這些標志物在PAH患者的RV中的定位，表明HGF /c-Met的多效性作用如先前在左心室中所證明的類似。與其他對照組相比，其他標志物在PAH患者的RV樣品中并未顯示出這種增加的表達，盡管受到可用樣品數量的限制，但這值得進一步研究。
動物模型為循環HGF水平的潛在來源帶來了一些見解。據報道，在古靈堿誘導的PAH中，在2周時HGF血漿水平升高，這與在4周時HGF和c-Met的RV mRNA表達增加相關，但在肝臟中則不存在，這表明HGF是心臟而非肝臟來源。我們的PAB模型進一步證明，與對照組相比，PAB RV勻漿中HGF和c-Met的基因表達增加，這表明PAH患者外周血和右心室中HGF循環水平的增加可能反映了HGF產生的增加。但這些數據不能得出關于RV中HGF增加是否反映了RV適應后負荷增加的補償性嘗試，或者它是否代表了適應不良有害反應的結論。
此前已經討論了HGF作為PAH療法的潛在有益作用，HGF增加了骨形態發生蛋白受體2的表達，其激活有益于PAH和RV衰竭。幾種動物模型（例如，由單腎上腺素誘導的PH大鼠，具有分流誘導的PH兔子）顯示，外源性HGF或HGF基因轉染可降低PH的發展，與對照組相比，右心肥大的癥狀減輕和炎癥性狀也降低；然而，HGF / c-Met軸激活在右心臟中的及時性和直接作用仍有待闡明，在此PAB模型對于探索血漿和組織中HGF表達的動態變化可能具有特殊價值。
總之，血漿高水平的HGF與PAH中的RHMP有關，與肺部疾病的嚴重程度無關，并且對于預測結果而言，其REVEAL評分會增加。由于PAH中RVHGF-cMet蛋白和基因表達均增加，因此該途徑作為潛在的RV特異性治療靶點值得進一步探索。
