編譯：Carota，編輯：景行、江舜堯。
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肌萎縮性脊髓側索硬化癥(ALS)和額顳葉癡呆(FTD)在臨床表現、病理和遺傳有很多共同點，并且這兩種疾病種也都伴隨著自身免疫性紊亂。C9orf72基因突變導致蛋白表達降低，大腦和外周血細胞重復突變的RNA和雙肽增加累積。本研究完全敲除了小鼠髓系細胞中的C9orf72，進而發現小鼠表現出年齡依賴性淋巴細胞肥大和自身炎癥，從C9orf72?/?小鼠中分離出來的樹突狀細胞顯示I型干擾素反應早期激活，而C9orf72?/?髓系細胞對干擾素基因(STING)蛋白刺激因子過度激活，同時自身溶酶體途徑對STING的降解減弱，激活了C9orf72?/?免疫細胞中的I型干擾素反應，造成了脾腫大和炎癥。此外，還發現缺少一個或兩個C9orf72基因拷貝的小鼠更容易患自身免疫性腦炎，這與C9-ALS/FTD患者對自身免疫性病的易感性相似，通過STING抑制劑可以降低I型干擾素。結果表明，C9-ALS/FTD患者由于C9orf72蛋白水平降低無法抑制由STING介導的I型干擾素炎癥反應最終導致免疫失調。
論文ID
原名：C9orf72 in myeloid cells suppresses STING-induced inflammation
譯名：髓系細胞中C9orf72抑制STING誘導的炎癥
期刊：Nature
IF：42.778
發表時間：2020年8月
通訊作者：Robert H. Baloh
通訊作者單位：美國洛杉磯西達賽奈醫學中心
DOI號：10.1038/s41586-020-2625-x
實驗設計
結果
C9orf72敲除小鼠表現出淋巴器官增生和年齡相關性全身炎癥。研究者發現C9orf72?/?小鼠在8周時出現有輕微炎癥和淋巴樣增生，在8個月時出現明顯的全身炎癥。DC亞型在C9orf72?/?小鼠中發育正常，隨著年齡的增長CD11b DC細胞上共刺激分子CD86的表達增加（圖1. a, b）。C9orf72?/?小鼠胸腺中的T細胞發育正常，但是記憶和效應記憶CD4和CD8 T細胞的數量甚至在8周時就增加了，并且隨著年齡的增長變得更加明顯(圖1.c, d)。
考慮到C9orf72在淋巴細胞中表達水平較低， 研究者將C9orf72fl/fl小鼠分別與Cx3cr1Cre和LysMCre小鼠進行雜交，以確定其髓系細胞的特有表型。C9orf72fl/fl小鼠體內中髓系群體(包括單核細胞、組織巨噬細胞和DCs13) C9orf72缺失；Cx3cr1Cre小鼠完全再現了脾腫大、DCs中共刺激分子表達的改變以及C9orf72完全敲除小鼠中可見的T細胞激活（圖1.e），同樣的現象也可以在C9orf72fl/fl；LyzMCre小鼠中觀察到，同時可能因為LyzMCre在DC中表達的較少(小于10%)，而Cx3cr1Cre表達超過90%，因此LyzMCre表現程度較輕。為了進一步探索適應性免疫細胞的非細胞自主表型，研究對對照、C9orf72?/?和C9orf72fl/fl;Cx3cr1Cre小鼠的脾細胞群進行了分類測序。對C9orf72fl/fl；Cx3cr1Cre小鼠的CD4和CD8 T細胞的通路分析顯示I型干擾素信號的選擇性上調，表明CD4和CD8 T細胞受到髓系細胞產生的I型干擾素反應的刺激（圖1.g-i）。
圖1. 幼齡和高齡C9orf72?/?小鼠DC發育和T細胞激活。a, b ：CD86在幼齡和高齡CD11c+脾DCs中的平均熒光強度(MFI) (a;n = 5, b;n = 6)；c,d：8周齡CD8 T細胞(c;n = 5)和8個月大 (d;n = 6)小鼠原始(CD62L+)、記憶(CD62L+CD44+)和效應記憶CD4 T和CD8 T細胞的流式細胞分析；e：左，C9orf72-Cx3cr1Cre小鼠5個月時脾腫大的大體圖像。右，脾臟重量； f：C9orf72-Cx3cr1Cre小鼠幼稚CD4和CD8 T細胞數量減少，CD4記憶T細胞和CD8效應記憶T細胞數量增加(n = 7)； g：GSEA檢測C9orf72-Cx3cr1Cre小鼠CD8 T細胞和CD4 T細胞中顯著上調的信號通路 (錯誤發現率(FDR)小于0.05)(n = 4)；h, i： RNA-seq的轉錄量(TPM)值，顯示CD8(野生型，n = 4;C9?/?，n = 3;Cx3CR1Cre, n = 3)和CD4 T細胞(野生型，n = 4;C9?/?，n = 3;Cx3CR1Cre, n = 4)中ISGs升高。
2 STING信號通過阻斷自噬途徑導致I型干擾素反應和炎癥的持續激活
為了確定C9orf72缺失的DCs激活適應性免疫細胞的因素，研究者對野生型和C9orf72?/?小鼠的脾classical DCs進行了RNA測序(RNA-seq)。 主成分分析(PCA)顯示兩種基因型分布不同，多種炎癥細胞因子在C9orf72?/?DCs中高表達，包括白介素IL-6，IL-10、IL-12β。用分層聚類進行的熱圖分析證實，四只小鼠中有三只的C9orf72?/? DCs中的典型I型干擾素應答基因顯著上調，而NF-κB信號無顯著差異（圖2.a, b）。
為了確定I型干擾素反應過度活躍的潛在驅動因素，研究者使用幾種激動劑 toll樣受體(TLRs)和胞質受體刺激野生型和C9orf72?/?骨髓源性巨噬細胞(BMDMs)。TLR3、TLR4和TLR7信號觸發了干擾素IFN-β的產生。然而與野生型BMDMs相比，在C9orf72?/?BMDMs中使用cGAS -STING通路的激動劑可IFNβ和干擾素刺激基因(ISGs)表達更加過度活躍(圖2.c-e)。
STING信號通過溶酶體阻斷自噬導致I型干擾素反應和炎癥的持續激活，鑒于C9orf72參與核內體運輸、自噬和溶酶體功能。研究者假設：C9orf72?/?細胞中STING降解被抑制，進而觀察到C9orf72-/-BMDMs受到 cGAMP刺激后，STING的降解延遲，并且STING在365絲氨酸上的磷酸化持續存在(圖2.f, g)，這表明STING通過干擾素調節因子3 (IRF3)促進干擾素持續激活。在C9orf72-/-BMDMs中LC3-II的基礎水平與對照組相比表達量明顯增加，并且在C9orf72?/?BMDMs中觀察到cGAMP激活STING 進而誘導LC3-II脂化進一步增加(圖2. h)。這一差異通過自噬抑制劑巴菲霉素A1的處理得以正常化，表明其部分原因是C9orf72缺陷細胞中LC3-II溶酶體降解降低所致(圖2.h)。這些數據建立了一個模型，在該模型中，通過自噬減少溶酶體對STING的降解導致晚期核內體中STING水平的增加，這可以作為持續干擾素誘導的平臺。支持這一觀點的是，cGAMP誘導C9orf72 BMDMs過度活躍的IFN可以被STING拮抗劑完全阻斷(圖2.i)。為了進一步確定C9orf72?/?小鼠I型干擾素信號升高是由STING在體內驅動的，研究者對C9orf72?/?小鼠和STINGgt/gt小鼠進行交配，比較發現比起STINGgt/gt 小鼠，C9orf72?/?小鼠脾腫大和髓細胞激活狀態都得到了緩解(圖2.j, k)。為了進一步描述C9orf72?/?小鼠脾腫大和髓細胞激活狀態得到緩解的特征，隨后研究者對野生型、 C9orf72?/?和C9orf72?/?、STINGgt/gt小鼠的脾臟細胞進行RNA-seq，分離的脾臟CD11b髓細胞、B細胞、CD4和CD8 T細胞中I型干擾素升高反應被STING的降低完全解除（圖2. l）。C9orf72?/?、STINGgt/gt小鼠全身炎癥表型并沒有完全解除可能是由于STING缺失本身促進TLR信號過活躍和炎癥反應，或者是因為C9orf72也可以調節與非STING相關的通路。無論如何，這些發現支持了在C9orf72?/?骨髓細胞增加STING活動促進了I型干擾素緩慢升高，這是C9orf72?/?小鼠系統性自身炎癥的關鍵部分。
圖2. 髓系細胞中C9orf72的丟失通過STING導致I型干擾素的增加。a, b：干擾素相關基因和NF-kB相關基因表達熱圖；c-e, qRT-PCR 分析野生型和C9?/?小鼠受到cGAMP刺激后BMDMs中的Ifnb1 (c)、Mx1 (d)和Cxcl10 (e)的表達情況；f：對cGAMP刺激0、6、9、24、小時或bafilomycin (Baf)刺激24小時的BMDMs進行Western blot分析，結果顯示與野生型細胞相比，C9?/?的STING降解延遲；g：左，STING磷酸化 (pSTING，絲氨酸365磷酸化)的western blot分析，右，從n = 3個生物重復實驗中量化pSTING；h：cGAMP刺激BMDMs 0、6、24、24小時或者在bafilomycin作用24小時的Western blot分析顯示LC3-II表達.；i：使用cGAMP刺激6小時后，qRT-PCR分析野生型和C9?/? BMDMs中Ifnb1的表達情況；j左側，8-10周(n = 7)時脾臟重量(毫克)標準化為體重(克)；右側，粗略的代表性圖像；k： qRT-PCR分析野生型(n = 6)、STING 缺失（Gt?/?；n=3）, C9?/?(n = 5)和C9?/?：Gt?/?(n = 6)小鼠的脾細胞中的Trem2和IL10；L：3月齡野生型(n = 4), C9?/?(n = 3)和C9?/?/Gt?/?(n = 4)小鼠脾臟CD11b細胞ISG表達的RNA-seq分析。
3 C9orf72?/?小鼠免疫表型改變導致自身免疫性疾病的易感性增強、抗腫瘤免疫增強
觀察到IL-12β在C9orf72?/?DCs中的高表達，其與IFNα/β相結合，可以促進T細胞向TH1表型分化，為了支持這一點，研究者發現IL-2和IFN的表達在受刺激的C9orf72?/?小鼠脾中增加并且表現出TH1表型的標記。IL-17的表達也呈顯著升高趨勢，IL-17的表達促進了TH17細胞的生成，進一步說明C9orf72?/?小鼠的慢性STING/ I型干擾素激活對適應性免疫細胞的刺激導致了自身免疫性疾病的傾向。
因此，研究者分析了C9orf72?/?小鼠是否更容易患自身免疫性腦炎（EAE）。觀察到，在缺乏C9orf72一個或兩個拷貝的小鼠中，臨床嚴重程度和脊髓炎癥呈分級的基因劑量依賴性增加（圖3. a, b）。雜合子小鼠對EAE敏感性的增加有重要意義，因為C9orf72的表達只在重復擴張載體組織中部分丟失，因此環境應激源的刺激是必要的。這支持了STING在DC 中慢性活化促進TH1偏向T細胞表型分化，TH1偏向T細胞在EAE過程中浸潤神經系統，導致炎癥反應增強。值得注意的是，髓系細胞慢性激活STING和C9orf72?/?小鼠中適應性免疫細胞的激活不同于EAE中急性激活STING，后者通過直接促進T細胞調節反應和抑制TH1反應來減輕嚴重程度。
有趣的是，研究也表明ALS患者中各種癌癥的發生頻率發生了改變。DCs在維持免疫系統的穩定中起著核心作用，自身免疫的傾向也與增強的抗腫瘤免疫能力有關. 因此，研究者檢查了抗腫瘤免疫模型 C9orf72?/?小鼠，測量靜脈注射小鼠B16黑色素瘤細胞后的腫瘤負荷。觀察到C9orf72在肺中的B16黑色素瘤腫瘤負荷中呈劑量依賴下降，缺少一個或兩個C9orf72拷貝的小鼠比野生型小鼠更耐受腫瘤(Fig. 3c–e)，這一反應伴隨著B16接種后肺和脾臟中活化T細胞數量的增加。這些數據與之前的研究一致，表明STING是介導啟動抗腫瘤CD8效應T細胞的關鍵。類似地， STING型干擾素對C9orf72?/?DCs腫瘤來源DNA的反應更有效地驅動細胞毒性抗腫瘤T細胞。總之，這些發現表明，在C9orf72?/?小鼠中觀察到的免疫表型改變(或在C9orf72丟失一個副本之后)導致自身免疫性疾病的易感性增強和抗腫瘤免疫增強。
圖 3. C9orf72?/?小鼠對EAE更敏感，與野生型小鼠相比，抗腫瘤免疫能力增強。a,b： 野生型(n = 13)， C9+/?(n = 13)和C9?/?(n = 10)小鼠EAE過程中的臨床評分(a)和體重(b)；c：野生型、C9+/?和C9?/?小鼠接種B16黑色素瘤14天后的代表性肺圖像；d, e： C9?/?小鼠的腫瘤集落數量減少(d;野生型，n = 8; C9+/?，n = 8;C9?/?，n = 9)，接種B16黑色素瘤細胞14天后黑色素含量降低 (e;野生型，n = 6;C9+/?，n = 8;C9?/?，n = 9)。
4 C9-ALS/FTD患者具有I型干擾素信號過度活躍的免疫失調表型
研究者使用RNA-seq檢測了正常對照組、散發性ALS患者和C9-ALS患者的血液單核細胞來源巨噬細胞(MDMs)，評估C9orf72重復擴增的髓系細胞中是否存在類似的免疫表型改變。基因集富集分析(GSEA)顯示，C9-ALS MDMs與散發性相比， IFNα/β信號通路相關的通路顯著上調，與C9orf72?/?小鼠免疫細胞中發現的上調通路幾乎相同（圖4.a-c；圖1.g）。此外，研究者通過外部驗證集證實了先前報道的C9orf72在C9-ALS攜帶者中的低表達(圖4. d)，觀察到C9-ALS患者相較于散發性ALS患者I型干擾素信號顯著上調(圖4. e)。
為了評估這種基因型驅動的炎癥特征是否存在于神經組織中，研究者分析了之前發表的ALS患者RNA-seq數據集。再次觀察到C9-ALS患者相較于散發性ALS患者小腦C9orf72表達水平降低和I型干擾素反應上調(圖4. f)。為了確定I型干擾素信號是否來自小膠質細胞，研究者檢測了cGAMP刺激后分離的小膠質細胞產生的IFNβ，觀察到STING激活狀態類似于C9orf72?/?小鼠外周血巨噬細胞(圖4.g)。最后，為了確定在C9-ALS骨髓細胞中觀察到的I型干擾素信號升高是否由STING驅動，用STING抑制劑處理了患者外周血單核細胞(PBMCs)或MDMs,觀察到STING抑制劑 H151沒有改變散發性ALS患者外周血細胞中ISG的基本表達，但在C9-ALS中持續抑制ISG的表達(圖4.h)。通過對C9-ALS患者的經H151治療的MDMs進行RNA序列分析，觀察到ISGs的廣泛抑制(圖4. i)。這些發現有力地支持了C9-ALS/FTD患者具有基因決定的免疫表型的觀點，其特征是I型干擾素信號過度活躍，其中部分是由STING激活驅動的。
圖 4.肌萎縮性側索硬化癥中C9orf72重復擴增患者外周血髓細胞中I型干擾素信號增強，可被STING拮抗劑抑制。 a：C9-ALS患者(n = 5)和散發性ALS患者(n = 5) MDMs的GSEA (FDR小于0.05)；b：C9-ALS,散發性肌萎縮側索硬化癥和正常對照組(n = 5)MDMs中I型干擾素刺激基因表達值；c, b：中干擾素刺激基因的qRT-PCR驗證(n = 3)；d：遺傳C9-ALS患者的RNA-seq (n = 20)顯示C9orf72表達低于散發性ALS患者(n = 259)； e：C9-ALS患者與散發性ALS患者全血RNA-seq中上調的通路：f：C9-ALS患者(8例)與散發性ALS患者(10例)小腦組織炎癥通路上調；g：qRT-PCR分析野生型(n = 4)和C9?/?(n = 4)小鼠大腦中分離的小膠質細胞在cGAMP刺激后產生IFNβ蛋白； h：對散發性ALS和C9-ALS患者有無STING抑制劑H151治療的PBMCs中MX1和STAT1的ISG mRNA進行qRT-PCR分析；i：H151治療和未治療的兩名C9orf72患者的MDMs的RNA-seq顯示干擾素刺激基因表達值，藍色表示百分比下降;紅色表示百分比增加。
結論
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END
