CRISPR/Cas9基因編輯技術大熱，非病毒載體技術助力遞送系統優化
絡繹學術 Online 直播第 12 期，我們邀請到了浙江大學教授、博士生導師平淵教授為我們分享基因編輯非病毒載體在疾病治療中的應用。基因編輯技術 (genome editing) 可以精確地破壞、插入或替換基因組中特定位點的 DNA 序列, 在基因功能的研究和遺傳疾病的治療中發揮著巨大的作用。人工核酸內切酶 (engineered endonuclease, EEN) 介導的基因編輯技術極大地改善了早期基于同源重組的基因打靶技術 (gene targeting) 效率低的問題, 使得科研工作者可以高效地對各種細胞類型和生物的任何基因進行編輯。目前，歸巢核酸內切酶 (Meganuclease)、鋅指核酸酶 (zinc finger nucleases, ZFN)、轉錄激活因子樣效應物核酸酶 (transcription activator-like effector nucleases, TALEN)、成簇規律間隔短回文重復序列 (CRISPR) 及其相關蛋白這 4 類工具酶，在基因編輯技術中應用最多。無論是 ZFN、TALEN 還是 CRISPR / Cas9，它們都是由 DNA 識別域與核酸內切酶兩部分組成，在結構上具備相似性。其中 ZFN 技術具有鋅指結構域能夠識別靶點 DNA，而 TALEN 的 DNA 識別區域是典型串聯 TALE 重復序列的中央結構域，DNA 剪切區域是一種名為 Fokl 的核酸內切酶結構域。CRISPR 的 DNA 識別區域就是 crRNA 或向導 RNA，Cas9 蛋白負責 DNA 的剪切。當 DNA 結合域識別靶點 DNA 序列后，核酸內切酶或 Cas9 蛋白將 DNA 剪切，靶 DNA 雙鏈斷裂，再啟動 DNA 損傷修復機制，實現基因敲除、插入等。圖 | ZFN 、TALEN 、 CRISPR 靶向切割 DNA 對比在作用過程上，它們也具有相似性。通過 DNA 識別模塊對特異性的 DNA 位點識別并結合，然后在相關核酸內切酶的作用下完成特定位點的剪切，從而借助于細胞內固有的 HDR 或 NHEJ 途徑修復過程完成特定序列的插入、刪除及基因融合。圖 | ZEN、TALEN 、CRISPR 的不同之處對比
通過和與其他技術的多方面對比，我們可以看到 CRISPR / Cas9 技術既有優勢，也有限制。那么 CRISPR / Cas9 技術的前世今生又有什么樣的故事呢？1987 年，日本微生物學家石野良純首次發現 CRISPR 。2012 年 Scribe Therapeutics 公司創始人之一 Jennifer Doudna 博士與 Emmanuelle Charpentier 博士利用 CRISPR 完成基因編輯。CRISPR 被認為是 21 世紀最重要的發現之一，于 2012 年、2013 年、2015 年 3 次入選 Science 評選的“世界十大科學突破”。規律成簇的間隔短回文重復序列 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats sequences, CRISPR) 是能為細菌和古生菌提供對病毒和質粒的適應性免疫的 DNA 重復序列。CRISPR 基因序列主要由前導序列 (leader)、重復序列 (repeat) 和間隔序列 (spacer) 構成。2002 年，Jansen 實驗室將臨近 CRISPR locus 的基因命名為 cas (CRISPR-associated) ，并發現了 4 個 cas 基因 (cas1, cas2, cas3, cas4)。CRISPR / Cas 系統是原核生物的一種天然免疫系統。某些細菌在遭到病毒入侵后，能夠把病毒基因的一小段存儲到自身的 DNA 里一個稱為 CRISPR 的存儲空間。當再次遇到病毒入侵時，細菌能夠根據存寫的片段識別病毒，將病毒的 DNA 切斷而使之失效。CRISPR 系統有 Ⅰ 型、Ⅱ 型和 Ⅲ 型，其中 CRISPR / Cas9 作為 Ⅱ 型研究最多，是繼鋅指核酸內切酶 (zinc finger nuclease，ZFN) 、類轉錄激活因子效應物核酸酶 ( transcription activator-likeeffector nuclease，TALEN) 之外出現的第 3 代基因編輯技術，其介導的基因編輯可用于生成轉基因模型、調節轉錄、調控表觀遺傳等。CRISPR / Cas9 系統主要是由 Cas9 蛋白和單鏈向導 RNA (sgRNA) 組成，其中 Cas9 蛋白具有切割 DNA 雙鏈功能，sgRNA 起導向作用。在原型間隔區相鄰的基序 (protospacer adjacent motif, PAM) 存在的情況下，Cas9 蛋白能在 sgRNA 導向作用下通過堿基互補配對到達不同的靶部位，切割靶基因實現 DNA 雙鏈斷裂 (double strand break, DSB) 。CRISPR/Cas9 技術工作中的 3 個關鍵因素向導 RNA：定位目標基因的一部分 RNA。這是在實驗室中設計的；
CRISPR 相關蛋白 9 (Cas9)：剪掉不需要的 DNA 片段的“剪刀”；
供體 DNA：原 DNA 鏈被剪斷之后插入的所需的 DNA 片段。
圖 | CRISPR - Cas9 介導的基因組編輯示意圖DSB 修復主要有兩種機制， 分別是非同源末端連接修復 NHEJ 和同源重組修復 HDR 。非同源末端連接 (non-homologous end joining, NHEJ) , NHEJ 介導的修復可在 DNA 雙鏈斷裂位點產生不精確的可變長度的插入和/或刪除突變。其它的非同源重組修復途徑也是存在的，比如微同源末端連接 (MMEJ, Microhomologymediatedend joining) 和單鏈退火途徑 (SSA, Single-strand annealing)。非同源修復的三種途徑 NHEJ 、MMEJ 和 SSA 的區別較為明顯。/ NHEJ 途徑修復 DSB 損傷是通過末端直接相連的方式進行的，這種連接不需要大片段的同源序列識別，而只需要 1-5 bp 的堿基配對就可以進行修復，屬于一種易錯修復。/ 與 NHEJ 修復途徑比較，MMEJ 修復與其最大的差別在于所識別的同源序列長度的不同。MMEJ 修復途徑需要 5-25 個堿基同源序列，會常常造成連接處發生同源片段的缺失或者基因重排。這也屬于易錯修復。/ 與 NHEJ 和 MMEJ 途徑相比較，SSA 途徑需要更長的同源序列 (>30bp) 來進行識別。SSA 途徑可以導致基因組的缺失，這是其與 MMEJ 途徑所類似之處。此外，SSA 與同源重組途徑類似，也被歸屬為同源序列依賴型的 DSB 修復模式，兩者都需要通過 5’到 3’的 DNA 剪切，產生 3’突出的單鏈 DNA。同源重組修復 (homology-directed repair, HDR) ，HDR 介導的精確修復可以從單鏈或雙鏈 DNA 供體模板引入精確的點突變或插入突變。“同源重組”機制在雙鏈 DNA 修復中具有十分重要的細胞生物學意義。DNA 同源重組修復是一條涉及到多個步驟的復雜的信號通路，其中關鍵蛋白為 BRCA1 和 BRCA2。如果 BRCA 基因出現突變導致 BRCA1 和 BRCA2 蛋白失去功能，就會引起 HRD 功能異常 (Homologous Recombination Deficiency, HRD) 和PALB2, CDK12, RAD51, CHEK2, ATM 等相關基因突變、或 BRCA1 基因啟動子發生甲基化導致基因組不穩定。當同源重組發生錯誤識別時，在非模板染色體執行“修復”可能會給細胞帶來無法預估的傷害。比如，錯誤的識別來自另一個親本的同源物，而不是姐妹染色單體作為模板來“修復”損傷的染色體。母本和父本染色體在許多位置上的 DNA 序列是不同的，因此，這種類型的修復可以將需要修復的 DNA 序列從母本轉變為父本序列，或從父本轉變為母本序列。圖 | 同源重組常導致基因 DNA 序列在染色體級別間互換由于 CRISPR 具有簡單、廉價和高效等優勢，因此它已經成為全球最為流行的基因編輯技術，被稱為編輯基因的“魔剪”。科學家通過它可以高效、精確地改變、編輯或替換植物、動物甚至是人類身上的基因，經過改造的 CRISPR 技術可被廣泛地應用于生物醫藥和其他領域。CRISPR 技術在許多領域的技術應用和聯用都取得了重大反響，人們在安全性，道德和監管等方面對其關注度也日益上升。CRISPR 技術應用前景廣闊，在醫療、能源、農業、工業等領域有望大放異彩開發新的診斷測試，靶向藥物和治療方法。通過將 CRISPR 與其他可切割目標 DNA 或 RNA 的 Cas 蛋白配對，然后切割其他分子以產生視覺信號，科學家可以確定何時存在病毒成分。科學家正在使用這項技術來開發診斷測試，以快速識別出諸如 COVID-19 之類的疾病。CRISPR / Cas9 正在測試用于某些疾病的可能治療方法，包括鐮狀細胞性貧血和某些類型的癌癥。CRISPR 也可用于通過改變昆蟲或其他可傳播疾病的生物的特性來幫助控制某些疾病。例如，科學家使用 CRISPR 使蚊子對引起瘧疾的寄生蟲更具抵抗力。開發生物燃料。基因編輯可以提高藻類生物燃料的產量。利用 CRISPR / Cas9 技術，科學家能夠找到并移除限制脂肪產生的基因。致力于研究商業化基因組學解決方案以解決全球能源與環境問題的美國生物技術公司 Synthetic Genomics 已經創造出了能產生兩倍脂肪的藻類，然后用于生產生物柴油。迄今為止，藻類尚未產生足夠高水平的脂肪以支撐生物柴油的大規模量產。通過 CRISPR / Cas9 技術，藻類將二氧化碳轉化為生物燃料的效率有望大幅提高。Synthetic Genomics 目前正與石油公司埃克森美孚 (ExxonMobil) 合作。預計此次合作將實現到 2025 年，每天生產 10,000 桶（石油計量單位，每桶相當于 120 - 159 升）藻類生物燃料的目標。更強壯，更抗病的農作物。CRISPR 可以通過增加營養成分，抗病性和在惡劣天氣和土壤條件下的生存能力來改善農產品。在傳統作物改良上，CRISPR 技術能帶來產量、品質、抗病性和抗除草劑性等方面的提升。在農業育種和加速作物馴化方面，CRISPR 與其他技術的聯用的創新層出不窮。目前，CRISPR 技術廣泛應用于模式植物（擬南芥、煙草）和一些主要農作物，比如我們常見的水稻、小麥、玉米等。CRISPR 技術也促進了植物基因功能研究和預期農藝性狀的選擇。例如，當研究人員刪除一小部分特定的黃瓜基因時，這些植物就不太容易受到已知會損害植物并造成嚴重農作物損失的病毒的侵害。CRISPR 基因編輯發明專家張鋒教授、David Liu 先生和 Keith Joung 先生共同創立了一家名為 Pairwise 的新型農業公司。該公司致力于利用基因編輯技術，以新的方式利用農作物的自然多樣性來應對全球糧食挑戰。更先進的工業產品。各個行業都在探索 CRISPR 潛在用途。除了開發新的生物燃料意外，可以解救環境災難的細菌以及新材料也是工業產品與 CRISPR 技術聯用的主要方向之一。專注于 CRISPR 的非治療應用的創新技術公司 Caribou Bioscience 就提供了基于 CRISPR 的工具用以改善工業發酵過程，革新化學品和酶的生產過程。他們還用 CRISPR 操縱微生物，生產新的化學品。潛在的新型生物材料包括香精、香精和工業清潔產品。CRISPR 基因編輯也引起了人們對其安全、道德和監管這三方面的關注安全問題。使用 CRISPR 可能會帶來意想不到的后果。例如，它可以靶向 DNA 內的“意外”位置，從而產生可能導致疾病或其他傷害的變化。盡管一些研究表明錯誤可能很少見，但仍然有待研究。此外，CRISPR 活性可能使細胞受壓并阻止編輯。雖然某些細胞可以在 DNA 改變后恢復，但很多細胞是不能恢復的。道德問題。倫理問題包括 CRISPR 是否將用于增強人類特征，例如增加的肌肉質量、學習能力和記憶力，以及是否可以公平地利用所有人群等。使用 CRISPR 編輯人類繁衍的影響也引發了倫理學問題。例如，遺傳變化會在多大程度上影響子孫后代，是否應該允許對人類胚胎進行研究等。監管挑戰。許多國家在如何規范 CRISPR 和其他基因編輯技術的問題上難以決斷。例如，在美國，目前尚不清楚基因編輯的作物是否將受到與常規轉基因 (GM) 生物相同的法規的約束。雖然 FDA 在 2017 年就開始尋求有關其監管政策的公眾意見，但是針對這一技術的行業新指南遲遲未發布。而在歐洲，2018 年的一項法院裁決確定，基因編輯作物將與轉基因植物受同樣的法規約束。有關基因編輯技術的監管仍然存在諸多問題有待解決。病毒是一類能對人體細胞及其它動物細胞進行有效感染的微生物。病毒的本領是把自己的基因高效地導入到宿主細胞里去，具有良好的基因遞送效能。因此，病毒被科學家們改造成為進行基因治療的主要遞送工具。在基因治療中使用最廣泛的病毒載體包括逆轉錄病毒 (retro virus, RV) 和慢病毒 (lentivirus, LV) 、腺病毒 (adeno virus, Adv) 以及腺相關病毒 (adeno associated virus, AAV) 等載體。逆轉錄病毒載體屬 RNA 病毒，但可在受染細胞內反轉錄產生 DNA 互補鏈，此 DNA 單鏈可作為模板合成第二條 DNA 鏈，第二條 DNA 鏈可摻入細胞基因組 DNA 中。此病毒可利用宿主細胞的酶自行轉錄與復制，RNA 可合成蛋白，再包裝病毒，RNA 從胞內釋放，成為感染性病毒，該載體可經不同方式改變。介導過程可使病毒單拷貝基因組穩定地進入細胞。慢病毒屬在分類上屬于逆轉錄病毒科，包括 8 種能夠感染人和脊椎動物的病毒，原發感染的細胞以淋巴和巨噬細胞為主，導致感染個體發病。慢病毒載體是一種單鏈 RNA 病毒，目前較為常用的病毒系統是四質粒系統。與其他逆轉錄病毒相比，慢病毒載體具備宿主更廣泛、對于分裂和非分裂細胞均具有感染能力，穩定表達和經過構建后可攜帶大約 5kb 及更長的目的基因的特點。腺病毒是無胞膜的線性雙鏈DNA病毒，目前腺病毒科分為 5 個屬。在臨床和科研中，主要使用的是 Adv5 型腺病毒載體。腺病毒載體系統一般應用人類病毒作為載體，以人類細胞作為宿主，屬于非整合型的病毒載體，因此為人類蛋白進行準確的翻譯后加工和適當的折疊提供了一個理想的環境。腺病毒載體還具備宿主范圍廣、對人致病性低、在增殖和非增殖細胞中感染和表達基因、有效增殖滴度高、無插入致突變性、能在懸浮培養液中擴增、能同時表達多個基因的特點。腺相關病毒是一類單鏈線狀 DNA 缺陷型病毒，屬微小病毒科。腺相關病毒基因組 DNA 小于 5kb，無包膜，外形為裸露的 20 面體顆粒。腺相關病毒載體具有安全性好，免疫原性低，能感染分裂細胞和非分裂細胞，能介導基因的長期穩定表達等優點。因此在神經系統的體內和體外研究中，腺相關病毒載體備受關注。目前病毒載體仍然是臨床試驗的主流載體。病體載體的優點是轉染效率高，但是缺點則包括特定人群無法使用、包裝容量有限、免疫原性強和缺乏組織靶向性等。其中，慢病毒宿主范圍廣, 基因容量大，感染效率高, 能整合基因到宿主細胞，實現長期穩定表達，常構建穩定株；腺相關病毒免疫原性低，多種血清型，體內擴散能力強，常用用于體內研究；腺病毒攜帶外源基因片段大，感染效率高，主要用于體外難感染的細胞。當然，其他類型的病毒載體也有很多，比如牛痘苗病毒 (vaccinia virus, VV)、單純孢疹病毒 (herpes simplex virus, HSV)、噬菌體載體等。以 HSV 病毒為例，HSV 病毒的滴度高、宿主范圍廣、外源基因容量大、對神經細胞具有特異性，但其毒性和免疫原性等因素有待進一步驗證。因此，HSA 病毒載體并未被廣泛應用。非病毒載體的使用原理是采用人工合成的載體材料的物理化學性質來介導基因的轉移。與病毒載體相比較，非病毒載體具有安全性高、包裝尺寸大、免疫原性弱、靶向性可控的優點，相對于病毒載體，非病毒載體成本較低、制備更簡單，便于大規模生產。在表達反義寡核苷酸等特殊外源基因片段中，病毒載體有著傳統病毒載體不可替代的作用。目前，正在研究的非病毒載體主要包括脂質體、分子偶聯受體、聚合物（聚-L-賴氨酸、聚乙烯亞胺等）、復合載體以及納米粒子載體等。常用的基因轉移脂質體包括陽離子、中性和陰離子脂質體，其中陽離子脂質體研究的最為廣泛；而應用于基因轉移的無機納米粒子主要包括硅、碳納米管、鐵氧化物等，它們主要通過穿過細胞膜將藥物或生物分子轉運到生物體中而起到治療疾病的作用。雖然非病毒載體仍存在轉染效率較低等問題，但是他們在基因治療領域扮演者越來越重要的角色。以基于脂質、類脂質的非病毒載體為例。陽離子脂質和類脂質載體可以借助靜電相互作用裝載核酸。目前這類非病毒載體 microRNA、siRNA 和 shRNA 等的遞送中得到了較為廣泛的應用。 同理它們也可遞送基于質粒 DNA、mRNA、RNP 的 CRISPR/Cas9 系統。很多結構新穎、性能優良的脂質和類脂質材料被設計出來用于載體構建, 這些載體往往需要 PEG 修飾。脂質載體經過 PEG 修飾實現長循環，通過被動靶向作用可蓄積于腫瘤組織，對其進行配體修飾或對脂質進行結構改造可以增強載體的靶向性, 促進細胞攝取，提高遞送效率。這類載體在屏蔽載體正電荷, 減少蛋白吸附后，其循環穩定性也得以提高，更能達到人體給藥的要求。圖 | 用于遞送 CRISPR / Cas9 系統的非病毒載體
高分子聚合物由短鏈重復單元聚合而形成。重復單元的結構高度可控的特點讓高分子聚合物可以根據所載物質的響應性需求被進行精確的設計。在結構上的多樣性和功能上的全面性讓高分子聚合物在遞送 pDNA 時的可能性更加寬闊。常用于遞送蛋白質的納米載體包括膠體納米顆粒（如脂質體和固體脂質納米顆粒）、聚合物納米材料（如聚合物膜、納米膠囊以及膠束）、無機納米載體（如碳納米管、量子點、介孔二氧化硅、磁性納米顆粒、金納米顆粒、金屬有機框架、黑磷納米片）等。磁性納米顆粒可以作為磁共振成像的造影劑；金納米顆粒可以產生光熱效應；量子點顆粒可以進行示蹤成像；還有些納米顆粒可同時搭載藥物與基因。這類非病毒載體不僅能將基因藥物有效遞送入細胞內，也能通過外部干擾達到最佳的抑癌作用。非病毒載體雖然優點明顯，但是非病毒載體在 CRISPR / Cas9 系統遞送過程中仍存在不少問題，比如在如何免受網狀內皮系統 (reticuloendothelial system, RES) 的識別及清除、如何實現該納米粒子在特定位置的富集、如何穿越由磷脂雙分子層所構成的呈疏水性的細胞膜等。可溶微針輔助基因治療，遞送糖皮質激素類藥物呈現新路徑浙江大學藥學院平淵教授團隊采用高特異性靶向 NLRP3 的 Cas9 核糖核蛋白 (RNP) 基因編輯技術，并以高效的經皮微針給藥糖皮質激素的方式有效治療炎癥性皮膚病 (ISDs)，該研究以題為 'Microneedle-assisted genome editing: A transdermal strategy of targeting NLRP3 by CRISPR-Cas9 for synergistic therapy of inflammatory skin disorders' 的論文發表在 Science 子刊《Science Advances》上。這一研究成果讓可溶性微針貼片基因編輯治療走進了人們的視野。
炎癥性皮膚病 (ISDs) 是最頑固的疾病之一，其特征通常是通過產生促炎細胞因子來激活先天性和適應性免疫應答。銀屑病和特異性皮炎 (AD) 等炎癥性皮膚病日益流行，成為威脅公共健康的主要問題之一。目前，患者僅能從少數的藥物中選擇治療方案，盡管糖皮質激素和免疫抑制劑是一線治療方案，但是經長期治療后大多數患者對糖皮質激素產生耐藥性，治療效果有限。因此，研發替代性的治療選擇是為糖皮質激素產生耐藥性的患者提供醫療方案的一個重要突破點。多數研究表明 NLRP3 激活與糖皮質激素耐藥性之間存在很強的相關性，雖然干擾激活NLRP3 上游的相關因子起間接作用以達到治療目的的小分子抑制劑相關研究眾多，但是口服后，能夠到達皮下層的藥物含量十分有限，并未達到高效的治療目的。因此提高安全性和有效性成了這一研發方向上的重中之重。平淵教授團隊開發的可溶性微針 (MN) 貼劑，微針中包封有靶向 NLRP3 的 Cas9 核糖核蛋白 (RNP) 的納米復合物，以及含有地塞米松 (Dex) 的納米復合物。當扎入皮膚后，微針可以快速溶解釋放兩種納米復合物，隨后被角質細胞和周圍的免疫細胞內化，從而有效治療皮下層炎癥。微針能透皮遞送 Cas9 RNP 和 Dex 納米復合物，破壞皮下細胞內 NLRP3 炎性小體，與 Dex 協同治療作用下能有效治療特異性皮炎 (AD) 和銀屑病。在篩選出 sgRNAs 序列時，發現 CMAX（一種商用轉染試劑）介導的 DC2.4 和 3T3 細胞中對 NLRP3 基因位點進行編輯，Indel 效率高達 35.4% 和 32.5% ，且也經過 Sanger 測序證實。此外，實驗發現在 DC2.4 細胞中添加 PLGA/Dex 納米復合物后，NLRP3 基因組位點的 Indel 效率從 29.6% 提高到 36.2% 。3T3 細胞中，Indel 效率也從 19.1 提高到 31.7%。結果證實，Dex 納米復合物中的 PLGA 可能會擴張核孔，促進Cas9 進核，提高對 NLRP3 基因位點的編輯活性。通過微針介導的分級遞送經皮治療策略，可最大限度地發揮基因編輯和糖皮質激素協同治療的治療效果。這一方法不僅在炎癥性皮膚病的治療方面極具潛力，而且也為經皮給藥和基因編輯療法的聯用提供了新的思路。由于目前非病毒載體基因治療領域的研究還是大多是在體外進行的，且體內外結果有一定差異。因此未來非病毒載體基因治療的發展與體內研究將更加關聯。首個非病毒基因治療產品，由俄羅斯人類干細胞研究所 (Human Stem Cells Institute) 于 2012 年推出；由一個編碼血管內皮生長因子 (VEGF-165) 的質粒載體組成；適應癥：治療嚴重肢端缺血。日本 AnGes 公司推出，已于 2019 年被批準適用于日本國民健康保險。Collategene 由pVAX1-HGF 組成，在人體內表達 HGF728 一種異構體。其主要適應癥為治療閉塞性動脈硬化癥和血栓閉塞性脈管炎。美國 Biogen 和 Ionis 制藥聯合開發，2017 年經 FDA 批準上市。它通過與 SMN2 基因轉錄形成的 mRNA 相結合，改變 RNA 的剪接過程，從而增加正常 SMN 蛋白的表達量。因此，這一療法可以在 SMN1 基因失活的 SMA 患者身上增加正常 SMN 蛋白的水平，從而維持運動神經元的生存。其主要適應癥是治療兒童和成人的脊髓性肌萎縮癥。非病毒和病毒載體均已實現用于各種應用的 CRISPR / Cas9 的遞送。基因治療也已經從基礎研究向藥物開發和工業化生產進行模式轉變。基因治療在治療血液瘤和罕見病領域市場空間充足，未來可期。隨著研發水平的提升和制備條件的改善，科學研究和臨床需求的結合程度與轉化流程的不斷提升，未來在保險支付的支持下，基因治療也終將有走進尋常百姓家的一天。絡繹知圖是集科技數據、智能分析、學術服務于一體的科技大數據平臺，以透視未來的科技本質為使命，面向學者、高校、科研機構以及從事科研成果轉化的相關群體，提供研究型數據庫、分析工具、學術會議、學術社區等功能，并通過媒體傳播原創研究有效放大學術研究的影響力。
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