近年來，大眾對大麻素的認(rèn)知已經(jīng)從一種非法藥物轉(zhuǎn)變成一種有前景的新處方藥，該藥物可用于治療癲癇、多發(fā)性硬化癥和慢性疼痛等疾病。其中，四氫大麻酚（THC）和大麻二酚（CBD）是兩種最廣泛研究且受臨床批準(zhǔn)的大麻素，通常僅存在于雌性植物花的毛狀體中。目前這兩種化合物的主要來源仍是大麻的提取物，這可能會浪費大部分植物生物質(zhì)，且后期純化也較為昂貴。
為了解決上述問題，研究人員開始尋求其他方法以增加大麻素的產(chǎn)量。其一是通過基因改造大麻以在植物的其他部位生產(chǎn)大麻素，并操縱代謝通量，從而提高所需化合物的產(chǎn)量；其二是利用合成生物學(xué)方法將從廉價原料生產(chǎn)大麻素的整條生物合成途徑引入大腸桿菌和酵母中。近年來，合成生物學(xué)發(fā)展迅速，利用第二種方法大規(guī)模化生產(chǎn)大麻素對于產(chǎn)業(yè)界來說越來越具有吸引力，但該方法與傳統(tǒng)植物來源競爭仍具有挑戰(zhàn)性。
隨著 DNA 合成成本的降低和基因組工程工具的改進，構(gòu)建菌株突變體的能力大大超出了篩選和識別高生產(chǎn)者的能力，液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）或可實現(xiàn)高生產(chǎn)者的高通量篩選，但使用 LC-MS 對于較小的研究團體和公司而言過于昂貴，這為代謝工程工作造成了瓶頸。
生物傳感器作為一種廉價而強大的工具，可用于檢測和量化各種代謝物。若將相應(yīng)元件（如細(xì)胞表面受體）與報告基因（如綠色熒光蛋白）的表達(dá)聯(lián)系起來，可以使用中等通量酶標(biāo)儀間接測定生長代謝物。近日，Nature Communications 上報道了一篇以“Screening microbially produced Δ(9)-tetrahydrocannabinol using a yeast biosensor workflow”為題的文章。在這篇文章中，研究人員提出了一種基于酵母的生物傳感器，可高通量檢測微生物產(chǎn)生的四氫大麻酚（THC），降低篩選成本。
酵母生物傳感器現(xiàn)已被開發(fā)用于檢測微生物產(chǎn)生的血清素、褪黑激素和脂肪酸，也被用作工程化益生菌來檢測和治療小鼠炎癥性腸病。基于之前報道的平臺，研究人員在酵母中開發(fā)基于 GPCR 的生物傳感器。GPCR 是一種哺乳動物 G 蛋白偶聯(lián)受體，可檢測范圍廣泛的配體和刺激物。
研究人員首先從已知對大麻素敏感的人類基因組中選擇了一組 GPCR：CB1R 、CB2R、GPR18、GPR55 和 GPR119，它們在內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)（ECS）中發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)多種生理功能。接著研究人員對五種人類 GPCR 的開放閱讀框（ORF）進行密碼子優(yōu)化以在酵母中表達(dá)，并將它們克隆到受強組成型啟動子控制的載體中。然后，研究人員將受體引入底盤菌株以及 12 個 Gɑ 蛋白文庫中，并測試所有 60 株菌株，以計算 GFP（綠色熒光蛋白） 表達(dá)的倍數(shù)變化。結(jié)果所示，只有 CB2R 在添加配體時顯示報告活性，且由于 CB2R 在標(biāo)準(zhǔn)條件下表現(xiàn)出高倍數(shù)變化，研究人員致力于利用這種受體進行生物傳感。
下一步，研究人員著手在酵母生產(chǎn)大麻素的背景下探索大麻素及其前體在 CB2R 生物傳感器上的劑量反應(yīng)曲線。
大麻素生產(chǎn)途徑：在該途徑中，直接前體橄欖酸 (OA) 和香葉基焦磷酸 (GPP) 結(jié)合形成大麻素網(wǎng)關(guān)前體大麻二酚酸 (CBGA)，然后 CBGA 通過各種合酶進行多樣化，以產(chǎn)生大麻中常見的大麻素，包括大麻二酚酸 (CBDA)，(Δ9)-四氫大麻酚酸 (THCA) 和大麻二色酸 (CBCA)。這些分子通過熱進行的非酶脫羧然后產(chǎn)生用于其治療效果的更熟悉的大麻素形式，例如大麻二酚 (CBG)、大麻二酚 (CBD)、四氫大麻酚 (THC) 和大麻色素 (CBC)。
研究人員首先測試了 CB2R 生物傳感器對 OA 和 GPP 的響應(yīng)，接著用 CBGA 在一定濃度范圍內(nèi)進行了劑量反應(yīng)實驗，最后，用治療相關(guān)的脫羧大麻素測試了 CB2R 生物傳感器的劑量反應(yīng)。結(jié)果顯示出 CB2R 生物傳感器能夠在很寬的濃度范圍內(nèi)測量大麻素、大麻二酚、四氫大麻酚和大麻色素，且也表明 CBG 為弱激動劑，CBD 為中度拮抗劑，THC 和 CBC 為強激動劑，這與報道的 THC 和 CBD 在人類中的作用非常吻合。
為了確定 CB2R 生物傳感器是否可用于篩選微生物產(chǎn)生的 THC，研究人員接下來著手從工程酵母細(xì)胞中進行檢測。首先創(chuàng)建了一種產(chǎn)生 THCA 的酵母菌株（yZ135），該菌株可生產(chǎn)大麻素并能通過脫羧將 THCA 轉(zhuǎn)化為 THC。一系列實驗操作后發(fā)現(xiàn)，在 140°C 下，THCA 的純樣品在 30 分鐘內(nèi)脫羧成 THC。由此，確定了 CB2R 生物傳感器工作流程孵育的最佳溫度和時間。
在建立樣品制備方案后，研究人員創(chuàng)建了一個基于 yZ135 的酵母菌株庫，并使用 CB2R 生物傳感器隨機挑選了 109 株進行篩選，看看是否可以使用 CB2R 生物傳感器測量生產(chǎn)中的相對差異，并確定任何具有改進的 THCA 生產(chǎn)的突變體。這為大部分位于生物傳感器線性范圍內(nèi)的 108 個菌株產(chǎn)生了高質(zhì)量數(shù)據(jù)，結(jié)果識別出比具有更高對照的信號 THCA 的 5 個菌株 (yS234) 。
然后團隊通過 LC-MS 測量脫羧樣品以直接量化相對 THC 量。直接比較 CB2R 生物傳感器輸出與相對 THC 量顯示出中等相關(guān)性，表明該生物傳感器有望在大規(guī)模篩選實驗中為改進的 THCA 生產(chǎn)者豐富文庫。
雖然 CB2R 生物傳感器被證明可用于從微生物生產(chǎn)中篩選 THC，但該生物傳感器有局限性。首先，研究人員無法將 THC 生物傳感器響應(yīng)與提取物中的其他大麻素分開，特別是 THCV 變體。為了改善這一點，可以進化 CB2R 受體以提高對 THC 的特異性。
研究人員還表示，期望未來看到更多基于 GPCR 的生物傳感器被用作代謝工程的工具。GPCR 可以檢測到的配體和刺激物的驚人多樣性提供了一個在很大程度上仍未開發(fā)的生物傳感元件來源。不過，挑戰(zhàn)依然存在，如此項工作所示，并非所有哺乳動物 GPCR 都能在酵母中進行功能性表達(dá)，之前報道的那些在沒有原始技術(shù)的情況下可能無法在其他環(huán)境中工作，需要開展工作以發(fā)現(xiàn)更普遍的原則，以改善 GPCR 在酵母中的表達(dá)、定位和偶聯(lián)。
