運動后呼吸頻率加快的神經機制，圖片來源網絡
2023年5月22日法國國家科學研究中心Julien Bouvier團隊在Nature Communications上發表文章“Upregulation of breathing rate during running exercise by central locomotor circuits in mice”，該研究揭示了小鼠中樞運動回路在跑步運動中上調呼吸頻率，闡明了運動后呼吸加快的神經環路機制。
呼吸對運動的適應是應對增加的代謝需求的必要條件，在哺乳動物中，呼吸節律是由延髓腹內側的前包欽格復合體（preB?tC）和面神經核旁呼吸組（pF）神經元驅動的，但關鍵的神經信號仍未知。在該研究中作者使用小鼠的神經回路追蹤和活動干擾策略并發現了兩個系統，中央運動網絡可以通過這兩個系統實現與跑步活動相關的呼吸增強。一個起源于中腦運動區(MLR)，這是一種保守的運動控制器。通過直接投射到產生吸氣節律的preB?tC神經元上，MLR可分為兩個亞區：谷氨酸能(Glut+)神經元的楔形核(CnF)和同時含有Glut+和膽堿能神經元的橋腳核(PPN)。MLR可以在運動之前或在沒有運動的情況下觸發呼吸頻率的適度增加。另一個是包含后肢運動電路的脊髓腰椎擴大。當被激活時，并通過投射到pF腦區的斜方體后核(RTN)上，可以有效上調呼吸頻率，它還是中樞呼吸核團中關鍵的二氧化碳化學感受器，監測體內CO2/H+變化調節呼吸的深度和速度，主要表達轉錄因子Phox2b和Atoh1。
圖一 病毒示蹤揭示CnF-preB?tC興奮性環路
作者首先在Vglut2-Cre工具小鼠CnF腦區注射順行示蹤病毒，preB?tC區域存在較多的投射纖維，在pF區域的投射纖維很稀疏。逆行示蹤實驗也進一步證實了上述結果。在光激活CnF-preB?tC興奮性環路后可促進吸氣爆發，并能縮短呼吸周期。通過進一步的實驗發現15HZ激活CnF-preB?tC環路可顯著促進小鼠向前運動，但不影響毛發梳理等其他行為，與此同時小鼠呼吸速率也增加，表明該環路調節呼吸與運動的協同作用。
圖二 谷氨酸能CnF神經元的光激活影響preB?tC中呼吸節律的產生
作者接下來測試了Glut+CnF神經元在功能上影響preB?tC的能力，preB?tC 對階段性傳入輸入的響應的一個標志是它們對正在進行的節奏的階段依賴性。為了評估CnF誘發的preB?tC反應，用全身體積描記法測量呼吸周期，在清醒和警覺的動物安靜呼吸期間，單脈沖(50毫秒)光激活是隨機傳遞的，光刺激沒有引起任何明顯的身體運動。結果發現Glut+ CnF神經元的單側光刺激會引發異位吸氣爆發并縮短呼吸周期，但這種效果在早期呼氣期間傳遞光脈沖時最為明顯。相比之下，在晚期呼氣時效果不明顯，作者還觀察到接下來兩個后續周期的縮短，這表明CnF的激活也決定了對preB?tC節律生成的更持久的調節作用。然而在對照小鼠的模擬試驗中沒有觀察到呼吸周期的改變。同樣，激活位于CnF側面但背腹深度相同的vlPAG的Glut+神經元，或位于背側但與CnF相同的中外側位置的下丘神經元不會影響呼吸周期。為了確定這種CnF驅動的呼吸節律生成調制是否由于對preB?tC的直接投射，在CnF中注射病毒后光激活preB?tC，結果導致類似的依賴于相位的呼吸周期縮短，當在早期呼氣時進行光激活時再次達到最大，這種影響在隨后的第二個呼吸周期后消失。對照小鼠的preB?tC中的光傳遞沒有產生明顯的效果。綜上，Glut+ CnF神經元的直接投射preB?tC神經元的相位依賴性激活，突出了吸氣爆發產生的興奮性調節。
圖三 谷氨酸能CnF神經元與運動協同上調呼吸
為了在劇烈運動期間獲取呼吸參數，且隔膜是主要的吸氣肌，作者利用了開發的隔膜(DiaEMG)慢性肌電圖記錄方法計算動物的位移速度。發現在15Hz或更高頻率下光激活Glut+ CnF神經元會使動物進行向前運動，縮短光開始和運動啟動之間的延遲并增加左右同步步態的發生。光刺激沒有引起任何梳理、處理行為或逮捕行為，也未觀察到防御性凍結或定向行為，這些行為分別是相鄰腹外側導水管周圍灰質或上丘或下丘激活的典型表現。CnF光刺激與呼吸頻率增加有關，在對照小鼠中沒有發現這種效果。在CnF光激活期間，呼吸頻率以兩步順序方式增加。在第一步中，在光開始但在第一次運動之前立即看到增加，這個階段的平均呼吸率明顯高于基線，但與光刺激頻率無關。在第二步中，當動物有效地進行運動時，呼吸頻率進一步增加，呼吸頻率仍然不依賴于刺激頻率，但它與實際位移速度成正比。DiaEMG的振幅在運動前階段沒有顯著變化，但在運動階段增加。這些結果表明，CnF誘發運動期間的呼吸頻率在運動開始前的光刺激時立即上調，并在實際運動期間進一步上調。低于運動起始閾值的光刺激足以從基線顯著增加呼吸頻率和DiaEMG的振幅。這些分析表明Glut+ CnF神經元可以在自發運動之前或沒有自發運動的情況下上調呼吸率，在CnF 誘發的運動期間，運動階段呼吸頻率的增加與位移速度成正比。
圖四 谷氨酸能腰椎脊髓神經元接觸pF呼吸區
為了探究實際運動的參與可能與對呼吸中樞有關，且可能源于激活的腰椎運動回路。作者在Vglut2 Cre鼠的腰椎雙側進行了病毒注射，發現preB?tC中的陽性投射纖維很少。為了區分通過的纖維與假定的突觸連接，作者首先用驅動突觸前、突觸素融合熒光團表達的病毒重復脊髓注射，并且在pF中觀察到熒光。接下來還使用病毒載體進行了類似的脊柱注射病毒在突觸后目標神經元中實現跨突觸表達，這導致在pF中大量表達eYFP陽性的細胞。由于pF不投射到腰椎脊髓，依賴性標記不是由病毒的逆行示蹤引起的，而是其順行突觸轉移。因此，上升的脊柱投射突觸靶向pF呼吸區。
圖五 脊髓-pF環路通過Phox2b/Atoh1神經元調控運動和呼吸活動
為了從功能上研究腰椎運動回路可以上調呼吸的可能性，于是使用來自新生小鼠的離體腦干/脊髓。作者進一步通過病毒示蹤實驗發現腰椎脊髓（L2）區域興奮性神經元投射到pF區域，在preB?tC區域幾乎沒有觀察到綠色投射纖維。體外新生兒腦干-脊髓培養實驗發現NDMA和5-HT可促進運動樣的同時增加呼吸樣活動，在截斷脊髓或者截斷pF或抑制RTN腦區Phox2b/Atoh1神經元活性后可阻斷呼吸頻率的增加，以上結果表明脊髓-pF環路通過RTN腦區Phox2b/Atoh1神經元調控運動和呼吸活動。
圖六 抑制RTN腦區Phox2b/Atoh1神經元減弱運動引起呼吸節律增加
為進一步證實RTN腦區Phox2b/Atoh1神經元調控運動中的呼吸活動，在休息狀態下運用化學遺傳學抑制該類型神經元后并不影響呼吸活動，但在運動過程中抑制該神經元后可明顯減弱小鼠呼吸頻率。病毒示蹤結果發現RTN腦區Phox2b/Atoh1神經元主要投射到preB?tC區域，光激活該環路后也可引起異位吸氣爆發，并縮短呼吸周期，這種上調呼吸節律的作用比激活CnF興奮性神經元出現的更早，結果表明RTN腦區Phox2b/Atoh1神經元可通過preB?tC呼吸中樞上調呼吸節律。
圖七 RTNPhox2b/Atoh1神經元接觸preB?tC并影響呼吸節律的產生
RTNPhox2b/Atoh1神經元沉默后呼吸頻率降低表明這種基因定義的神經元子集可能使用主要的吸氣發生器preB?tC。為了證明RTNPhox2b/Atoh1神經元在 preB?tC中直接調節節律生成機制的能力，作者使用用于CnF激活的相同分析工具檢查了對50ms單脈沖光激活的呼吸反應。發現RTNPhox2b/Atoh1神經元的單側光刺激可以引起異位吸氣爆發并縮短呼吸周期。然而，與CnF光刺激相比，呼吸周期的縮短在吸氣階段更早達到峰值，與CnF相反，呼氣末期的刺激導致呼吸周期明顯延長。同樣，刺激RTNPhox2b/Atoh1神經元會導致與preB?tC興奮性動力學保持一致的相位依賴性吸氣反應。與CnF不同的是沒有觀察到刺激后后續周期的縮短。此外，1 s光刺激RTNPhox2b/Atoh1神經元導致刺激期間呼吸頻率顯著增加，這主要是由于Te的減少，即使在最低刺激頻率下也是如此。以上結果表明，RTNPhox2b/Atoh1 神經元的基因定義子集可以通過直接投射到preB?tC上調呼吸頻率。
綜上所述，本文揭示了運動后呼吸活動增強的兩條神經環路，一條為CnF興奮性神經元投射到呼吸中樞preB?tC的直接通路，另外一條是脊髓興奮性神經元投射到pF，并進一步通過RTN-Phox2b/Atoh1神經元投射到preB?tC的間接通路。除了確定呼吸過度的關鍵基礎之外，該研究還擴展了通常被認為與“運動”或“呼吸”相關的細胞類型和通路的功能意義。
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37217517/
