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大量證據表明糖尿病和抑郁癥之間存在雙向聯(lián)系，尤其是在過去30年中。在一些研究中，糖尿病是抑郁癥的一個原因，而另一些研究報告抑郁癥顯著增加了糖尿病的風險。在此，我們主要關注糖尿病誘發(fā)的抑郁，并探討其潛在的機制。糖尿病是一種典型的代謝性疾病，其特征是慢性高血糖癥和胰島素分泌不足和/或功能低下。根據臨床表現(xiàn)和發(fā)病機制，可分為不同類型，包括1型（T1 DM）、2型糖尿病（T2 DM）、妊娠期糖尿病（GDM），以及糖耐量減低（IGT）和空腹血糖受損（IFG）。關于糖尿病相關的抑郁，已經表明與非糖尿病對照相比，抑郁在患有T1 DM的人中是約三倍，在患有T2 DM的人中是兩倍。在此期間，不僅有近三分之一的糖尿病患者存在抑郁癥狀，而且糖尿病患者存在高水平的糖尿病困擾，這可能介導抑郁癥的發(fā)生。此外，共病抑郁癥可能干擾治療過程和結果，導致自我管理和醫(yī)療依從性不足，血糖控制不良，生活質量下降和死亡風險增加。目前對于其合并癥的機制假說主要有：糖尿病的心理負擔和不良生活方式、高血糖的生物學效應如氧化應激、下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸功能障礙、全身低度炎癥和糖尿病微血管并發(fā)癥等。但無論是在因果關系、反向因果關系還是共土假說中，炎癥反應都被認為是一個不可忽視的關鍵因素。
白細胞介素-1 β（IL-1β）是參與糖尿病和抑郁癥發(fā)生發(fā)展的最重要的炎癥介質之一，一方面，IL-1β可能通過誘導內質網和線粒體應激損傷胰腺β細胞，導致胰島素分泌不足。它還可促進IRS-1絲氨酸磷酸化，促進肝臟和脂肪組織胰島素抵抗，進而參與T1 DM和T2 DM的發(fā)病；另一方面，已證明IL-1β可通過激活HPA軸、破壞犬尿激酶途徑、促進谷氨酸興奮性毒性、影響神經可塑性或其他方式誘導抑郁癥狀。事實上，IL-1β的成熟是由稱為炎性體的多蛋白復合物操縱的，具體機制為慢性高血糖癥可以通過增強活性氧物質（ROS）和硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）的產生來激活NLRP 3炎性體，其隨后導致胱天蛋白酶-1依賴性IL-Ι β成熟和分泌。近年來，我們已經發(fā)現(xiàn)NLRP 3炎性小體在慢性應激和脂多糖（LPS）小鼠模型中介導抑郁樣行為，此外，已經證明NLRP 3基因的缺失中止了小鼠中應激誘導的抑郁樣行為。因此，我們推測糖尿病誘導的抑郁癥行為可能與炎癥小體NLRP 3激活有關，而其內在的機制聯(lián)系也是值得我們探索的。
在此背景下，2023年7月27日由海軍軍醫(yī)大學心理研究學院蔣春雷團隊在Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry上發(fā)文揭示了糖尿病誘導的抑郁癥行為與NLRP3炎性小體的激活觸發(fā)的神經炎癥反應有關的機制。
圖1通過STZ誘導的糖尿病（高血糖）小鼠模型的代謝和行為學檢測
第一組實驗是檢測糖尿病小鼠模型的行為學和代謝情況。首先課題組將30只C57/BL/6小鼠接受腹膜內注射劑量為200 mg/kg的STZ(鏈脲佐菌素)。注射后兩天，對他們進行空腹血糖水平篩查。以血糖超過300 mg/dL為界限定義為高血糖，隨機分為D組8只、C組7只、B組7只（血糖不達標）和A組8只（空白對照）。在10天左右時檢測小鼠的體重、血糖等代謝指標，表明糖尿病模型組C組和D組相較于正常組來說體重和血糖水平變化較大，但C組和D組對比表明，通過抑制炎癥小體并不能改善血糖水平。同樣在10天左右時給予焦慮抑郁相關的雌性尿嗅實驗、懸尾實驗和曠場實驗，尿嗅實驗表明C組嗅氣味的時間明顯縮短，懸尾實驗表明C組的制動時間明顯延長，曠場實驗表明C組中央區(qū)的滯留時間減少。實驗證明，高糖刺激能導致小鼠的抑郁焦慮行為，但通過抑制炎性小體NLRP 3，對抑郁行為有所改善。
圖2 中樞和外周神經膠質和炎性小體相關生物標志物的檢測
然后，課題組對神經炎癥和炎性小體相關蛋白進行蛋白印記實驗。糖尿病模型C組IBa1表達明顯升高，而GFAP差異無統(tǒng)計學意義，炎性小體NLRP3、caspase-1和IL-1β等均表達明顯升高，加入抑制劑D組其表達含量相較于C組均有所下降，并且C組IL-1β的含量為最高。該組實驗證明在糖尿病的高糖刺激下，存在炎性小體激活的狀態(tài)。
圖3 體外不同葡萄糖濃度下NLRP3炎性體的表達和活化
接著，課題組為求進一步驗證在不同濃度的葡萄糖刺激下，炎性小體的活化表達情況，進一步完善了Western Blot實驗，高糖HG2組在INOS、NLRP3、caspase-1以及IL-1β表達及含量均為最高，本次CCK-8細胞活性實驗表明差異無統(tǒng)計學意義，不同劑量葡萄糖本身對細胞無損傷作用，排除細胞本身損傷激活相關應激反應因素。本組實驗表明，高糖濃度刺激下，炎性小體容易激活。
圖4 體外不同葡萄糖濃度下的NLRP3炎性小體活化信號I
為進一步驗證刺激炎性小體活化的機制信號通路，課題組對信號I相關蛋白進行蛋白印記實驗。在不同劑量葡萄糖的刺激下，TLR4和MyD88的表達無明顯差異，無統(tǒng)計學意義。而在高糖刺激下的HG1組和HG2組在P-p65和p65的表達量顯著升高，而p65作為NF-κB信號家族的分子之一，推測高糖通過刺激NF-κB信號的p65從而激活下游的炎性小體。但本次探索的機制較為復雜，課題組尚未完全證明其間的關系。本實驗只能證明，體外高糖環(huán)境促進典型炎性小體激活信號I的關鍵分子NF-κB p65亞基磷酸化。
圖5 .TLR 4和NF-κB抑制劑分別對高糖誘導的NLRP 3炎性小體活化的影響
課題組為進一步驗證上述猜想，在本次實驗中進行回復實驗，將TLR4抑制劑TAK-242以不同劑量組觀察信號下游分子相關蛋白表達情況，在0、0.5、1.0等不同劑量抑制劑組中IL-1、MyD88\p65等表達情況無明顯差異，表明TLR4抑制后并不會影響下游的信號分子表達情況。
實驗G通過加入NF-κB抑制劑觀察，炎性小體相關蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)隨著抑制劑量增大，NLRP3\Caspase-1、IL-1β的表達情況，呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，通過將圖4實驗和圖5實驗結合，說明NF-κB信號參與了炎性小體的活化激活。
圖6 體外不同葡萄糖濃度下的NLRP3炎性小體激活信號II
接下來課題組將針對信號II對炎性小體的激活進行探討。設置不同葡萄糖濃度的劑量組對ROS/PKR/P2X7R/TXNI相關通路分子的影響。發(fā)現(xiàn)HG1組和HG2組相較于其他對照組來說PKR/P2X7R/TXNI的表達量均有所上升，ROS 活性氧的產生同樣有差異，只是相對不明顯。本實驗表明高糖刺激影響了ROS/PKR/P2X7R/TXNI信號II分子表達。
圖7 .P2X7R和PKR抑制劑分別對高葡萄糖誘導的NLRP3炎性小體活化的影響
本實驗進一步驗證信號II具體哪一環(huán)節(jié)分子起作用抑制炎性分子的表達。分別對P2X7R和PKR抑制，觀察IL-1β的表達情況。隨著各組抑制劑量加大，IL-1β的表達情況逐漸表現(xiàn)為下降趨勢。結合圖6實驗，說明P2 X7 R或PKR特異性抑制劑體外阻斷高糖環(huán)境誘導的IL-1β生成。
圖8 ROS清除劑NACs對高糖誘導的NLRP3炎性小體活化的影響
本實驗通過對ROS的抑制進一步探索對信號II其他分子和炎性小體的表達的影響。本實驗發(fā)現(xiàn)隨著抑制劑量逐漸增加，對于P2X7R的表達無明顯影響，而對于PKR磷酸化與TXNIP的表達均有明顯影響，此外，隨著抑制劑量的增加相關炎性小體的蛋白表達呈下降趨勢，表明ROS清除劑NAC可抑制PKR的磷酸化和TXNIP的表達，阻斷高糖誘導的NLRP 3炎性小體的活化和IL-1β的產生。
圖9 NLRP3選擇性抑制劑MCC950對高糖誘導的NLRP3炎性小體活化的影響
本實驗通過對炎性小體NLRP3的選擇性抑制，觀察其相關炎性分子表達情況。隨著抑制劑量組的增加，NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表達均有不同程度下降趨勢。本實驗說明，NLRP3抑制劑MCC950體外有效抑制高糖環(huán)境誘導的小膠質細胞NLRP3炎性小體活化。
綜上所述，本文揭示了STZ誘導的糖尿病小鼠會出現(xiàn)抑郁和焦慮樣行為。而抑郁樣行為制與海馬體中小膠質細胞的炎性小體NLRP3活化相關，而本實驗分別從信號I和信號II驗證炎性小體激活的機制。信號I驗證了TLR 4/MyD 88/NF-κB通路是構成NLRP 3炎性體激活信號I的重要部分。它可以上調前體蛋白的表達并引發(fā)炎性小體。當探索激活信號II時，我們集中于可能與高血糖誘導的炎癥小體激活相關的幾種分子靶標，包括P2 X7 R、ROS、TXNIP和dsRNA依賴性蛋白激酶（PKR），發(fā)現(xiàn)高葡萄糖通過刺激炎癥因子激活小膠質細胞NLRP 3。上調P2X7R，增強ROS產生，并促進PKR磷酸化和TXNIP表達來發(fā)揮作用。本次研究，為更易患抑郁癥的糖尿病患者確定了新的診斷和治療策略。
DOI: 10.1016/j.pnpbp.2023.110796
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