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最近，有粉絲運行了我以前的數據挖掘成套代碼里面的 run_kegg 函數，如下所示：

library(clusterProfiler) 
run_kegg(gene_up,gene_down,pro='comp1')

出現了如下所示的報錯：

Reading KEGG annotation online:

fail to download KEGG data...
Error in download.KEGG.Path(species) : 
  'species' should be one of organisms listed in 'http://www.genome.jp/kegg/catalog/org_list.html'...
In addition: Warning message:
In utils::download.file(url, quiet = TRUE, method = method, ...) :
  URL 'https://rest.kegg.jp/link/mmu/pathway': status was 'Failure when receiving data from the peer'
Called from: download.KEGG.Path(species)

然后就找我，以為是我們的標準代碼有問題，實際上我的 run_kegg 函數僅僅是包裝了 Y叔的 clusterProfiler包而已 ，實際上里面沒有啥玄機，如下所示：

## KEGG pathway analysis
### 做KEGG數據集超幾何分布檢驗分析，重點在結果的可視化及生物學意義的理解。
run_kegg <- function(gene_up,gene_down,pro='test'){
  library(ggplot2)
  gene_up=unique(gene_up)
  gene_down=unique(gene_down)
  gene_diff=unique(c(gene_up,gene_down))
  ###   over-representation test
  # 下面把3個基因集分開做超幾何分布檢驗
  # 首先是上調基因集。
  kk.up <- enrichKEGG(gene   = gene_up,
 organism  = 'mmu',
 #universe  = gene_all,
 pvalueCutoff = 0.9,
 qvalueCutoff =0.9)
  head(kk.up)[,1:6]
  kk=kk.up
  dotplot(kk)
  kk=DOSE::setReadable(kk, OrgDb='org.Mm.eg.db',keyType='ENTREZID')
  write.csv(kk@result,paste0(pro,'_kk.up.csv'))
  
  # 首先是下調基因集。
  kk.down <- enrichKEGG(gene   =  gene_down,
   organism  = 'mmu',
   #universe  = gene_all,
   pvalueCutoff = 0.9,
   qvalueCutoff =0.9)
  head(kk.down)[,1:6]
  kk=kk.down
  dotplot(kk)
  kk=DOSE::setReadable(kk, OrgDb='org.Mm.eg.db',keyType='ENTREZID')
  write.csv(kk@result,paste0(pro,'_kk.down.csv'))
  
  # 最后是上下調合并后的基因集。
  kk.diff <- enrichKEGG(gene   = gene_diff,
   organism  = 'mmu',
   pvalueCutoff = 0.05)
  head(kk.diff)[,1:6]
  kk=kk.diff
  dotplot(kk)
  kk=DOSE::setReadable(kk, OrgDb='org.Mm.eg.db',keyType='ENTREZID')
  write.csv(kk@result,paste0(pro,'_kk.diff.csv')) 
}

就是針對上下調基因，以及其合并的差異基因，分別獨立走 enrichKEGG 函數而已，它來自于 Y叔的 clusterProfiler包。

實際上，我們根據前面的報錯，進入  https://www.genome.jp/kegg/catalog/org_list.html 可以很清楚的看到，我們的人和鼠，都是在里面的：

hsa   Homo sapiens (human)
mmu   Mus musculus (house mouse)

所以不可能是物種問題，而且這個kegg數據庫的官網也可以訪問，那么合理的推測，是不是Y叔的 clusterProfiler包有問題呢？其實仔細看報錯提示是 download.KEGG.Path 函數問題，也是Y叔的包里面的。這個download.KEGG.Path 函數的代碼是：

 keggpathid2extid.df <- kegg_link(species, "pathway")
 if (is.null(keggpathid2extid.df)) 
  stop("'species' should be one of organisms listed in 'http://www.genome.jp/kegg/catalog/org_list.html'...")
 keggpathid2extid.df[, 1] %<>% gsub("[^:]+:", "", 
  .)
 keggpathid2extid.df[, 2] %<>% gsub("[^:]+:", "", 
  .)
 keggpathid2name.df <- kegg_list("pathway")
 keggpathid2name.df[, 1] %<>% gsub("path:map", species, 
  .)
 keggpathid2extid.df <- keggpathid2extid.df[keggpathid2extid.df[, 
  1] %in% keggpathid2name.df[, 1], ]
 return(list(KEGGPATHID2EXTID = keggpathid2extid.df, KEGGPATHID2NAME = keggpathid2name.df))

也就是說在kegg_link函數就開始報錯了，繼續看kegg_link的代碼：

url <- paste0("http://rest.kegg.jp/link/", target_db, 
  "/", source_db, collapse = "")
 kegg_rest(url)

實際上， 它就根據我們的物種，拼湊了一個 網頁，比如：https://rest.kegg.jp/link/hsa/pathway，可以使用瀏覽器打開，能看到里面的通路的id和基因id的對應關系。所以真正的問題是 kegg_rest 這個函數，沒有辦法像瀏覽器那樣直接獲取網頁里面的內容。我們繼續看kegg_rest 這個函數的源代碼：

 dl <- mydownload(rest_url, destfile = f)
 if (is.null(dl)) {
  message("fail to download KEGG data...")
  return(NULL)
 }

真氣人，就是一個套娃， 里面又是mydownload函數，那我們繼續看mydownload函數的源代碼 ：

if (is.null(method)) 
  method <- getOption("clusterProfiler.download.method")
 if (!is.null(method) && method != "auto") {
  dl <- tryCatch(utils::download.file(url, quiet = TRUE, 
   method = method, ...), error = function(e) NULL)
 }
 else {
  dl <- tryCatch(downloader::download(url, quiet = TRUE, 
   ...), error = function(e) NULL)
 }
 return(dl)

有意思的是，我看了看，它里面的兩個下載函數（utils::download.file和  downloader::download）我都測試了，是可以獨立下載的：

utils::download.file( "http://rest.kegg.jp/link/hsa/pathway" ,
tempfile()  )
#  downloader::download 也可以

trying URL 'http://rest.kegg.jp/link/hsa/pathway'
Content type 'text/plain; charset=utf-8' length unknown
downloaded 807 KB

但是這兩個下載函數（utils::download.file和  downloader::download），我是使用默認參數進行下載，都沒有設置協議，我看了看函數里面的協議是：

 getOption("clusterProfiler.download.method")
[1] "libcurl"

也就是說，它們兩個下載函數（utils::download.file和  downloader::download）使用默認的方法，也就是 'auto'  是可以去訪問我們的瀏覽器可以訪問的：https://rest.kegg.jp/link/hsa/pathway，的內容。但是如果給它們 "libcurl"的協議，就會失敗。

所以，最簡單的解決方案就是修改這個默認的協議即可，我給一個解決方案，就是：

install.packages('R.utils')
R.utils::setOption( "clusterProfiler.download.method",'auto' )

果然，接下來的富集分析就非常絲滑了。

出圖如下所示：

KEGG數據庫沒有倒閉， Y叔的 clusterProfiler包也問題不大，我的一個 run_kegg 函數更不可能有問題。僅僅是因為R語言里面的下載文件的函數的協議需要注意，這兩個函數兩個下載函數（utils::download.file和  downloader::download），都太底層了。初學者確實不容易找到問題所在。