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噬菌體輔助連續進化（PACE）每天可進行數十代的突變、選擇和復制，從而可產生具有提高目標序列兼容性和更高活性的堿基編輯器。

研究人員使用這種BE-PACE系統來進化胞嘧啶堿基編輯器CBE，以克服野生型CBE的靶向序列限制性。獲得的進化CBE之一，被命名為evoAPOBEC1-BE4max，在GC環境中編輯胞嘧啶的效率可提高達26倍，同時在所有其他測試序列環境中均可保持有效編輯——這顯著突破了野生型APOBEC1脫氨酶所受GC環境下的限制。另一種名為evoFERNY的進化脫氨酶，比APOBEC1小29％，并能夠在所有測試的序列背景中有效編輯。

研究人員指出，嘧啶堿基編輯器CBE是最常用的堿基編輯器，而限制CBE效率的一個因素是APOBEC1的天然序列背景偏好——它對GC motifs編輯效率很低。位于編輯窗口中心的GC目標可以被基于APOBEC1的CBE有效編輯，但其他GC不行。先前的研究表明，雖然含有不同胞苷脫氨酶的CBE可以更有效地編輯GC靶標，但非APOBEC1的CBE替代品偏偏在其他靶標——比如在人類細胞中的各種靶標上——的平均性能低于APOBEC1-CBE。

鑒于這些挑戰，研究人員嘗試使用噬菌體輔助連續進化（PACE）嘧啶堿基編輯器CBE——噬菌體輔助連續進化系統每天可進行數十代的突變、選擇和復制，從而可產生具有提高目標序列兼容性和更高活性的堿基編輯器。在PACE期間，感興趣的活性與編碼具有該活性的生物分子的M13噬菌體相匹配。在BE-PACE系統中，該回路必須通過單堿基變化來激活，響應少量編輯事件并快速開啟，以便在連續稀釋條件下能支持噬菌體繁殖。

為了滿足這些要求，該團隊設計了一個基因回路，其中需要在某個轉錄模板鏈上發生胞嘧啶脫氨作用，以恢復某個蛋白質中的失活突變。研究人員構建了這個低嚴謹度的、帶有一個需要編輯GC的靶標以支持大量噬菌體繁殖的BE-PACE回路，結果使得宿主細胞培養物中過夜噬菌體增殖近10倍，對堿基編輯噬菌體的選擇性超過1,000倍。在進一步的驗證實驗中，他們發現BE-PACE產生了性能改善的脫氨酶。

在經過連續的PACE回路之后，他們分離出那些在GCC1回路上顯示出可測量弱活性的突變噬菌體，這最后得到了表現最佳的噬菌體克隆——當在熒光素酶分析的GCC1回路上測試時，其活性顯示出高達28倍的提高。

為了確定熒光素酶測定中所得到的表觀活性改善是否能轉化為改進的哺乳動物細胞基因編輯，該團隊將一組進化的脫氨酶變異體亞克隆到BE4max堿基編輯器的結構中并將它們轉染到HEK293T細胞中，同時以靶向5個先前實驗表明能夠進行有效編輯的基因組位點的Guide RNA對照。

“在最優化的質粒劑量和條件下，我們觀察到活性窗口中心的編輯效率達到最高約60％至80％，可能受限于CBE非依賴性因子——如轉染效率或細胞DNA修復過程，”作者表示， “值得注意的是，對于所有進化的堿基編輯器，在遠離活動窗口中心的位置進行編輯均得到了改善，這些位置的編輯值與熒光素酶測定活性相關。在APOBEC1 CBE中，包括H122L和D124N在內的進化突變導致在GC目標進行的堿基編輯發生了顯著地改善。”

基于這些結果，研究人員對每種脫氨酶都選擇了一個表現好的進化變體來深入表征：evoAPOBEC1，evoFERNY和evoCDA1。他們創建了BE4max變異體并測試了它們的編輯活動，并對一組24個CBE變異體進行了表征，以剖析進化突變的作用。他們發現在APOBEC1 PACE期間，在1,189個天然存在的APOBEC序列中有不到1％出現了關鍵的H122L和D124N突變進化，并且通常是共同發生。

“EvoAPOBEC1-BE4max在GC目標上的表現顯著優于現有的CBE BE4max和AncBE4max，同時在非GC目標上表現出相似或更高的活性，”作者總結表示， “evoAPOBEC1-BE4max的堿基編輯窗口與BE4max的堿基編輯窗口非常相似。盡管與APOBEC1相比其大小縮小了29％，但在非GC目標的CBE中，evoFERNY與APOBEC1相當，在GC目標上evoFERNY更有效。EvoFERNY-BE4max顯示進一步改善了對GC目標的兼容性，與evoAPOBEC1-BE4max相比，可提供相似或更高的編輯水平。

然而，研究人員補充說，在他們的所有實驗中，evoCDA1-BE4max顯示出脫靶編輯的增加。因此，他們建議將其用于最適合其特性的精心選擇的應用中。“在好的編輯位點上，這種CBE可以產生更高的indels而不會增加異常水平的編輯，顯示更寬的編輯窗口。” “相比之下，在不好的編輯位點，它顯示了增加的窗口內編輯水平，而沒有增加indels。這些考慮表明，evoCDA1-BE4max應該用于高效編輯優先且脫靶和旁側編輯不重要時。”

過往回顧

2019年5月20日，David Liu在Nature Biotechnology 在線發表題為“Circularly permuted and PAM-modified Cas9 variants broaden the targeting scope of base editors”的研究論文，該研究使用循環置換的Cas9變體產生四個胞嘧啶和四個腺嘌呤堿基編輯器，編輯窗口從——4-5個核苷酸擴展到最多——8-9個核苷酸和減少副產物的形成。這組堿基編輯器改進了胞嘧啶和腺嘌呤堿基編輯的靶向范圍。

2019年5月17日，David Liu團隊在Nature Communications上發表題為“Development of hRad51–Cas9 nickase fusions that mediate HDR withoutdouble-stranded breaks”的文章，報告了通過將hRad51變體與可編程切口酶融合以產生hRad51-Cas9（D10A）切口酶融合物（RDN變體），實現具有最少副產物和減少脫靶編輯的無DSB HDR。

2019年5月13號，David Liu團隊在Nature Chemical Biology上在線發表了題為“Substrate-selective inhibitors that reprogram the activity of insulin-degrading enzyme ”的研究論文，該研究發現了能改變IDE底物選擇性的強效和高特異性的小分子抑制劑。這些發現為開發IDE靶向療法提供了一條道路，并為以底物選擇性方式調節其他酶以釋放其治療潛力提供了藍圖。

2019年5月8日， David R. Liu團隊在Science Advances 在線發表題為“Analysis and minimization of cellular RNA editing by DNA adenine base editors”的研究論文，該研究證明當前的ABE在細胞RNA中產生低但可檢測水平的廣泛的腺苷 - 肌苷編輯。使用結構指導原則設計脫氨酶結構域中的突變，開發了新的ABE變體，在三種哺乳動物細胞系中保留了它們有效編輯DNA的能力，但顯示出大大降低的RNA編輯活性，以及較低的脫靶DNA編輯活性和減少的插入缺失副產物（通過在TadA中引入E59A或E59Q突變以及在TadA *中引入V106W突變，從ABE中鑒定出廣泛的，低水平的細胞RNA編輯，其大大減少，而基本上不犧牲靶上DNA編輯） 。通過解耦DNA和RNA編輯活動，這些ABE變體通過最小化RNA和DNA脫靶編輯活性來提高腺嘌呤堿基編輯的精確度。

2019年4月26日，David Liu在Nature Communications上發表題為“High-resolution specificity profiling and off-target prediction forsite-specific DNA recombinases”的文章，開發了一種快速繪制SSR特異性決定因素的方法。這種方法也可用于預測SSR的細胞脫靶活性，這是評估SSR作為潛在工具或治療劑時的重要考慮因素。研究結果表明，Rec-seq可以為SSR的應用及其進一步發展提供信息。

2019年2月25日，David Liu團隊在Nature Medical Bioengineering 在線發表題為“ Adenine base editing in an adult mouse model of tyrosinemia”的研究論文，該研究使用基于CRISPR系統的堿基編輯器，第一次成功地在成體小鼠模型中治療了由于G->A基因突變導致的這種罕見肝臟疾病。

2019年2月12日，David Liu團隊在Nature Chemical Biology 上在線發表了題為“Side chain determinants of biopolymer function during selection and replication”的研究論文。研究揭示在選擇和復制過程中生物聚合物功能的側鏈決定因素，這些因素將可能有助于蛋白質在某些分子識別任務中比其核酸前體具有明顯優勢。

基因組編輯使用可編程核酸酶產生雙鏈DNA斷裂然后進行同源定向修復可引入多種修飾，但在非分裂細胞中效率低，并且通常伴有過量的不需要的插入和缺失，易位或其他染色體重排。堿基編輯直接修飾活細胞中的靶DNA堿基，并已廣泛用于糾正人類胚胎的生物體中的點突變。堿基編輯使用催化受損的Cas9在指定的基因組位點打開單鏈DNA環，編輯窗口內的堿基（通常約5個核苷酸寬）通過僅接受單鏈DNA的堿基修飾酶修飾。到目前為止，已經開發了兩類基本編輯器：CBE將C·G轉換為T·A，ABE將A·T轉換為G·C。