結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化系統惡性腫瘤，在最新統計的全球癌癥發病率和死亡率排名中均位居前列[1]，其高發病率和高死亡率嚴重威脅人們的生命健康。CRC的發生、發展機制復雜，其中涉及多種腫瘤相關基因及腫瘤相關信號通路的改變。
近年來，中藥以其多途徑、多靶點的優勢，在輔助治療CRC方面取得了良好的療效。丹參-赤芍是臨床上抑制惡性腫瘤發生發展常用的活血化瘀藥對，其中，丹參是唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根莖，《本草綱目》草部中記載其味苦，性微寒，無毒，歸心、肝經，具有祛瘀生新、活血止痛的功效[2]。赤芍是為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.或川赤芍P. veitchii Lynch的干燥根，味苦，性微寒，歸肝經，具有清熱涼血、活血祛瘀的功效[3]。本研究基于網絡藥理學及分子對接技術篩選丹參-赤芍藥對治療CRC的相關靶點和通路，并將篩選后的活性成分與靶蛋白進行分子對接，探討丹參-赤芍藥對是否能夠多靶點、多途徑抑制CRC的發生發展，并運用體外細胞實驗對相關靶點進行驗證，以期為中醫藥防治CRC提供新思路。
通過在TCMSP數據庫中查找到丹參-赤芍的活性成分并按照篩選條件進行篩選，得到活性成分206個，藥物作用靶基因352個。
將GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DurgBank數據庫檢索的CRC相關靶點結果合并，去除重復數據，篩選得到CRC相關靶點9143個，見圖1。將丹參-赤芍藥對的潛在靶點與CRC相關靶點取交集映射，利用Perl軟件繪制韋恩圖，共得到283個交集靶點，見圖2。
將篩選后的丹參-赤芍活性成分、交集靶點以及中藥信息導入Cytoscape 3.8.2軟件進行可視化分析，獲得“中藥-活性成分-潛在治療靶點”網絡圖，見圖3。
將藥物與疾病共有靶點導入STRING數據庫，得到PPI網絡（圖4），共有131個節點、520條邊。
使用插件CytoNCA提取網絡中得分較高的節點，以介數和自由度的中位數作為截點，根據條件選擇排名前11的靶點為ESR1、CTNNB1、RB1、特化蛋白1（specialized protein 1，SP1）、原癌基因SRC、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JUN）、信號傳導與轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF1A）、周期依賴性激酶抑制劑1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）、細胞周期素D1（cyclin D1，CCND1），取排名前3的靶點即ESR1、CTNNB1、RB1作為關鍵靶點（圖5），進行后續研究。
根據R語言程序設定條件進行GO功能富集分析，富集結果按照P值從小到大排序，選取前10條GO條目輸出氣泡圖。如圖6所示，丹參-赤芍藥對主要影響藥物反應、氧化應激響應等生物過程（biological process，BP），影響膜筏、膜微域等細胞組分（cellular components，CC），參與酰胺結合、肽結合等分子功能（molecular function，MF）。
分析藥物與疾病共同靶點進行KEGG通路富集分析，根據P值進行排序，得到丹參-赤芍藥對治療CRC的相關通路30條，見圖7。通過分析氣泡圖結果并結合腫瘤相關通路研究可知，丹參-赤芍藥對治療CRC的潛在靶點主要集中在磷脂酰肌醇3-激酶（
phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、p53信號通路、HIF-1信號通路、細胞凋亡等信號通路上。
根據PPI分析結果，選取度值排名前3的靶基因（ESR1、CTNNB1和RB1）所編碼的靶蛋白（ESR1、β-catenin和RB1）與丹參-赤芍藥對的活性成分進行分子對接，結果顯示，丹參-赤芍藥對中活性成分黃芩苷、芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷、木犀草素、芍藥苷、二沒食子酸、異歐前胡素、異隱丹參酮、淚柏醇、鞣花酸等與關鍵靶點對接穩定（表2）。對結果進一步分析發現，芍藥內酯苷與ESR1結合能力較強，分別在LEU346、GLU353、ARG394形成H鍵，結合能為?67.481 kJ/mol；苯甲酰芍藥苷與β-catenin結合能力較強，分別在SER448、ARG474形成H鍵，結合能為?37.983 9 kJ/mol；苯甲酰芍藥苷與RB1結合能力較強，分別在LYS765、TYR756形成H鍵，結合能為?36.384 6 kJ/mol（圖8）。
如表3所示，不同質量濃度的丹參-赤芍對HCT116細胞均有一定的抑制作用，且呈劑量相關性。運用SPSS 25.0統計軟件計算出藥物作用于HCT116細胞48 h的半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）為459.303 μg/mL。根據IC50值和本課題組前期實驗，給藥質量濃度選擇在459.303 μg/mL以下。選擇100、200、400 μg/mL的丹參-赤芍進行后續實驗。
如圖9所示，與對照組比較，各給藥組細胞遷移率顯著降低（P＜0.05、0.01），其中丹參-赤芍高劑量組作用最佳。
如圖10所示，與對照組比較，丹參-赤芍藥對各劑量組ESR1 mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05、0.01），丹參-赤芍藥對高劑量組CTNNB1 mRNA表達水平顯著降低（P＜0.01），丹參-赤芍藥對中、高劑量組RB1 mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05）。
如圖11所示，與對照組比較，丹參-赤芍藥對各劑量組ESR1和β-catenin蛋白表達水平均顯著降低，RB1蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05、0.01）。
如圖12所示，與對照組比較，丹參-赤芍藥對高劑量組Caspase-3蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），丹參-赤芍藥對中、高劑量組PARP蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05、0.01）。
中醫認為CRC病位在大腸，與脾胃密切相關。《靈樞·百病始生》提到：“腸胃之絡傷，則血溢于腸外，腸外有寒，汁沫與血相摶，則并合凝聚不得散，而積成矣。”患者多因脾失健運，血行不暢，日久致瘀，瘀血搏結腸道，損傷腸絡，日久成癰而致癌腫，常見腹痛拒按、舌質紫暗或有瘀斑、脈澀等臨床表現，故臨床治療CRC多加入丹參、赤芍等活血類中藥[8]。
本研究利用網絡藥理學，深入挖掘丹參-赤芍治療CRC的有效成分、潛在靶點和作用機制。共篩選到丹參-赤芍藥對的活性成分206個，丹參-赤芍藥對治療CRC的潛在靶點283個，并通過PPI網絡分析篩選出ESR1、CTNNB1及RB1為關鍵核心靶點。其中，ESR1是CRC發生、發展和轉移中最重要的調節基因，是誘導CRC的潛在機制[9]。一項基于GSCA的遺傳改變分析表明，ESR1基因的突變可能是誘發CRC致癌的潛在機制，并且與生物學進展與免疫反應有關[10]。CTNNB1基因編碼蛋白β-catenin是Wnt信號傳導的關鍵組成部分，在CRC進展中起著至關重要的作用[11-12]。β-catenin在正常結直腸上皮組織中定位于細胞膜，而在癌變過程中β-catenin從細胞膜游離，在CRC癌組織中主要表達于細胞質和細胞核中。其在CRC癌組織中異常高表達與腫瘤的分化、侵襲、轉移密切相關[13]。
研究顯示，槲皮素、木犀草素、芹菜素等中藥單體通過Wnt/β-catenin通路對CRC的不同階段（包括癌前病變、CRC早期和晚期）發揮抗腫瘤作用[14]。β-catenin可能是CRC患者的臨床預后的重要生物標志物。RB1是腫瘤抑制基因，RB1表達水平與腫瘤的大小、淋巴結轉移及臨床預后密切相關，RB1可以通過限制細胞周期進展從而抑制腫瘤的發展進程[15]。有研究發現RB1在前列腺癌、乳腺癌、CRC、非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤進展過程中失活[15-18]。腫瘤細胞中的RB1缺失會誘導脂肪酸氧化并激活JNK，激活后的JNK通過刺激IL-6的產生，進而促進STAT3介導的干細胞樣行為和惡性進展。也有研究分析發現，RB1是CRC發生晚期肝轉移及腹膜轉移的核心基因，并且可能與腫瘤浸潤淋巴細胞相關途徑有關[19]。
本研究通過MTT及劃痕實驗驗證了丹參-赤芍藥對對HCT116細胞的增殖和遷移能力具有明顯的抑制作用，并且通過qRT-PCR及Western blotting實驗分別在基因和蛋白水平驗證了丹參-赤芍藥對對網絡藥理學篩選出的核心基因ESR1及CTNNB1（編碼蛋白β-catenin）的表達具有明顯的抑制作用，對RB1表達具有明顯的促進作用。因此，核心基因ESR1、CTNNB1及RB1有可能在丹參-赤芍藥對抑制CRC發生發展過程中發揮了關鍵作用。
GO功能富集分析發現丹參-赤芍藥對對藥物反應、氧化應激等BP，膜筏、膜微域等CC，酰胺結合、肽結合等MF產生影響，并且KEGG通路富集分析得到丹參-赤芍藥對主要通過PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、p53信號通路、HIF-1信號通路、細胞凋亡等信號通路抑制CRC的發生發展。其中PI3K/Akt是與腫瘤發生發展密切相關的信號通路，在調控CRC細胞增殖、侵襲、細胞周期等行為上發揮重要的作用。研究表明，HER2在CRC癌組織中的高表達水平與PI3K/Akt通路的激活有關，PI3K可以驅動HER2的表達，促進腫瘤干細胞增殖能力[20]。
杠柳次苷是一種潛在的抗癌化合物，研究發現杠柳次苷可以通過靶向PI3K/Akt通路，促進細胞凋亡來發揮抗CRC作用[21]。TNF-α是CRC中常見的促炎細胞因子，可通過激活JNK信號通路調節BaP和PhIP誘導的CRC上皮細胞DNA損傷。TNF-α誘導的DNA損傷又能被功能性p53抑制[22]。CRC中增強的糖酵解和磷酸戊糖途徑與HIF-1α表達增加有關，活性氧（reactive oxygen species，ROS）/ PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信號激活HIF-1α誘導的代謝重編程，從而在CRC治療過程中促進機體對5-氟尿嘧啶產生耐藥性，降低臨床療效[23]。故PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、p53信號通路、HIF-1信號通路、細胞凋亡等信號通路與CRC的發生發展密切相關。
利用分子對接技術篩選出丹參-赤芍藥對中有效成分黃芩苷、芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷、木犀草素、芍藥苷等與關鍵核心靶點對接能力較強，這與本課題組前期進行的UPLC-Q-TOF/MF實驗篩選出的藥物有效成分相一致[4]。其中，黃芩苷介導了多種癌癥相關信號通路的調節[24]，其可以通過上調孕酮誘導的蛻膜蛋白（DEPP）和激活Ras/Raf/絲裂原活化蛋白激酶（MEK）/細胞外調節蛋白激酶（ERK）信號傳導誘導CRC細胞的衰老[25]，也可以通過減少c-Myc的表達來誘導CRC細胞凋亡并抑制腫瘤生長[26]；芍藥內酯苷可通過核因子-κB（NF-κB）/環氧化酶-2（COX-2）信號通路抑制潰瘍性結腸炎大鼠發生炎癥反應，抑制結腸組織氧化反應，減輕結腸組織病變，從而阻斷CRC“炎-癌”轉化進程[27]；苯甲酰芍藥苷、木犀草素、芍藥苷等也具有很好的抗腫瘤活性作用[28-30]。
綜上所述，本研究基于網絡藥理學、分子對接技術及體外實驗證明了丹參-赤芍藥對能夠通過多通路、多靶點在CRC治療中發揮重要的作用，為丹參-赤芍藥對治療CRC提供了客觀依據。
利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突
參考文獻（略）
來 源：王方園，王 棟，孔憲斌，時浩洋，趙 爽，楊玉瑩，孟靜巖．基于網絡藥理學和分子對接研究丹參-赤芍藥對治療結直腸癌的作用機制 [J]. 中草藥, 2022, 53(18): 5731-5741 .
