肥胖是由體內脂肪積聚過多而致，并由脂肪細胞的數量和大小決定。脂肪細胞主要分為兩類：負責儲藏能量的白色脂肪細胞和負責產熱的棕色脂肪細胞（棕色脂肪細胞又分為典型棕色脂肪細胞和米色脂肪細胞）。通過激活棕色脂肪細胞產熱，提高機體能耗，已成為治療肥胖及代謝相關疾病的研究熱點。
組蛋白去乙酰化酶(HDACs)可以從組蛋白或非組蛋白底物中去除乙酰基團，廣泛參與了多種生物過程，其中就包括參與棕色和米色脂肪生理功能的調控。但HDACs調節脂肪細胞產熱的機制尚不明確。
2021年6月，復旦大學代謝分子醫學教育部重點實驗室PI、基礎醫學院生物化學與分子生物學系潘東寧研究員課題組在Advanced Science (IF 15.804) 雜志上在線發表題為“PWWP2B Fine-Tunes Adipose Thermogenesis by Stabilizing HDACs in a NuRD Subcomplex”的研究成果，該研究利用蛋白質組學技術探究了組蛋白去乙酰化酶調節脂肪細胞產熱的分子機制。中科新生命提供了蛋白組學技術支持。
【研究材料】
小鼠、脂肪組織和脂肪細胞
【技術方法】
蛋白質組學、免疫共沉淀、QPCR、免疫熒光染色、染色質免疫共沉淀等
【方法流程】
研究結果
1. PWWP2B蛋白在棕色和米色脂肪組織中富集
研究發現PWWP2B與核小體結合，將相關的染色質修飾酶招募到目標位點。研究人員利用轉錄組、QPCR和WB實驗，首次揭示PWWP2B在小鼠脂肪中的表達分布。PWWP2B在棕色脂肪組織（BAT）的水平顯著高于米色脂肪組織（WAT），包括附睪WAT(eWAT)和腹股溝WAT（eWAT）。PWWP2B表達水平隨著棕色脂肪細胞分化遞增(圖1a和1b)，冷誘導和激動劑Cl316243(一種有效的脂肪細胞脂解刺激劑，可增加棕色脂肪組織的生熱作用和代謝率)處理均提高PWWP2B水平 (圖1c-1f)。綜上，PWWP2B在脂肪組織中富集且受條件誘導表達。
PWWP2B蛋白在脂肪組織中的表達
2. PWWP2B缺失可增強適應性產熱和白色脂肪褐變
為研究PWWP2B在脂肪組織中的功能，作者構建了PWWP2B基因敲除小鼠模型(Ad-KO)，發現Ad-KO小鼠分離的BAT和BAT細胞中PWWP2B蛋白減少(圖2a)，產熱標志蛋白Ucp1、Cidea、Prdm16、Cox8b和Pgc1α顯著上調(圖2b-2d)，Ad-KO小鼠背部表面溫度升高(圖2e，2f)。激動劑Cl316243處理的Ad-KO小鼠 iWAT和eWAT脂肪細胞表達更多的褐化蛋白UCP1(圖2g-2i)，氧耗率也更高(圖2j)。綜上，PWWP2B在脂肪組織中增強適應性產熱，調控白色脂肪褐變。
PWWP2B敲除增強適應性產熱
3. PWWP2B缺失改善飲食誘導的肥胖
為了研究脂肪組織中PWWP2B缺失是否會改變全身的能量消耗，研究人員用高脂飲食(HFD)誘導Ad-KO小鼠，發現Ad-KO小鼠的體重增加的更慢，原因是脂肪含量減少(圖3a，3b)，Ad-KO小鼠產熱量和夜間耗氧量增加，呼吸交換率降低 (圖3c-3f)，且改善了葡萄糖耐量和胰島素敏感性(圖3g，3h)。Ad-KO小鼠的BAT和iWAT中的脂滴大小顯著減小，肝臟中的空泡也較少(圖3i，3j)。Ad-KO小鼠的BAT中Ucp1蛋白和mRNA水平增加(圖3k，3l)。胰島素信號在脂肪組織和肝臟中得到改善 (圖3m，3n)，冷誘導Ad-KO小鼠有較高的核心溫度(圖3o)。綜上，PWWP2B在棕色和米色脂肪細胞中都是負調控因子。
高脂飲食對Ad-KO小鼠的影響
4. PWWP2B抑制產熱程序是脂肪細胞自主的
為了探討PWWP2B對產熱過程的抑制作用是否是細胞自主的，研究人員構建了PWWP2B敲除的永生化棕色前體脂肪細胞模型，并利用Western blot證實構建的準確性 (圖4a)。PWWP2B敲除細胞中產熱基因Ucp1, Prdm16, Pgc1α和Cox8b的表達水平顯著增加(圖4b-4d)，與Ad-KO小鼠中產熱基因變化一致（圖4e，4f）。為了補充PWWP2B的功能，研究人員又在成熟的棕色脂肪細胞進行了重復實驗，也得到相同的結果（圖4g-4j）。綜上，PWWP2B是脂肪細胞產熱的分子制動器，避免過度活躍產熱和適當維持能量穩態。
PWWP2B自主抑制產熱
5. PWWP2B穩定NURD復合體中的HDAC1
為了闡明PWWP2B缺失能夠激活脂肪細胞產熱的機制，研究人員利用免疫沉淀和LC-MS/MS等技術，證實PWWP2B蛋白存在于棕色脂肪細胞核及產熱基因Ucp1, Pgc1α和 Cox8b的啟動子區域(圖5b)，且PWWP2B和HDAC1/2/3互作(圖5c,5d)。在成熟的棕色脂肪細胞中過表達PWWP2B增加HDAC1的蛋白水平，而在原代米色脂肪細胞中PWWP2B缺失顯著降低了HDAC1蛋白的表達(圖5e-5g)。泛素化實驗表明PWWP2B通過降低HDAC1泛素化水平來穩定HDAC1(圖5h，5i)。綜上，PWWP2B通過與產熱基因的啟動子結合發揮調節作用，同時提高HDAC1蛋白的穩定性。
PWWP2B穩定HDAC1
6. PWWP2B調節Ucp1啟動子上組蛋白乙酰化水平
為了證明PWWP2B調控產熱基因是否與HDAC有關，研究人員發現HDAC1的化學抑制劑消除了PWWP2B對Ucp1和Cox8b表達的抑制作用(圖6a，6b)，也減少HDAC1與Ucp1和PGC1α的結合 (圖6c)。PWWP2B敲除細胞中，Ucp1啟動子上的乙酰化H3K27和H4水平增加(圖6d，6e)，HDAC1對Ucp1表達的抑制作用降低(圖6g)。PWWP2B敲除小鼠中，Ucp1啟動子區H4乙酰化水平升高(圖6f)。綜上，PWWP2B和HDAC1在產熱脂肪細胞中的功能是相互聯系和相互依賴的。
PWWP2B抑制產熱基因表達需要HDAC1
7. PWWP2B調節脂肪細胞產熱的模型建立
PWWP2B在NuRD亞復合體中聯合并穩定HDAC1/2，以促進產熱基因啟動子上的脫乙酰化，作為抑制過度活躍產熱的分子制動器。在沒有PWWP2B的情況下，較少的HDAC1/2粘附在啟動子上，微妙地激活脂肪細胞中的產熱程序。
PWWP2B調節脂肪細胞產熱的模型
小結
本研究構建PWWP2B基因敲除小鼠和細胞模型，揭示了PWWP2B在棕色/米色脂肪組織中通過招募并穩定組蛋白去乙酰化酶HDAC1/2，負向調控脂肪組織產熱的分子機制。盡管PWWP2B被證實對脂肪組織產熱功能實施負調控作用，但PWWP2B在棕色脂肪組織中表達水平顯著高于白色脂肪組織，且寒冷刺激和交感神經興奮可以進一步誘導PWWP2B的表達，表明PWWP2B是棕色脂肪細胞內在的產熱反應制動裝置，可有效避免棕色和米色脂肪細胞產熱功能的過度激活。本研究為以組蛋白去乙酰化酶復合物為靶點，治療肥胖、糖尿病等代謝性疾病提供新的思路。
